细胞生物学实验课.pptVIP

四、作业与思考 根据PCC图像的观察，试说明对于理解细胞周期和DNA复制有什么启示? 简述细胞融合的原理。 PCC实验的主要意义是什么？ 实验三 小鼠MEF饲养层的制备 一、实验目的 1.掌握常用饲养层的制备原理和方法。 2.巩固细胞培养相关的的技术。 二、实验原理 胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES）的体外培养要求增殖的同时保持未分化的状态，因此，我们要进行体外培养胚胎干细胞，必须环境中满足两个条件：细胞生长因子和分化抑制因子。体外培养的成纤维细胞可以分泌细胞生长因子和分化抑制因子，前者可以促进ES细胞的增值，后者可以有效的抑制ES的自主分化。目前，可以用来制作饲养层的细胞有多种，其中原代小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast, MEF）取材方便，易于铺层，分泌能力强而成为ES细胞首选的饲养层细胞。 将原代培养的MEF细胞进行传代，多为3－6代，这样不仅可以使得MEF细胞的纯度较高，而且生长状态也很好。在制备饲养层前将MEF细胞用丝裂霉素C或射线照射预处理，抑制DNA的复制使其在保持分泌功能的基础上失去增值能力，以免与ES的生长发生竞争。 在具体实验中，MEF细胞的原代分离时胎龄的选择，作为饲养层使用时细胞代数的选择，丝裂霉素处理的浓度都会影响饲养层培养体系的质量。 胎龄过大，则成纤维细胞的成分降低，分离效率低下，且易混杂其他细胞，难以去处。若胎龄过小，胚胎形态小，躯干部分不易分辩，操作困难。 细胞代数过多，则出现衰老征象；细胞代数过少，不容易纯化。 丝裂霉素的浓度处理和处理时间直接影响细胞的状态。 二、实验方法与步骤 1.MEF的获取： （1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵 （2）2：1合笼过夜 （3）取出有阴道栓的开始记时间为0.5天 （4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料 （5）无菌 取出胚胎 （6）去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部 （7）用眼科剪刀剪成1mm3组织块 （8）0.25%胰蛋白酶消化20min/室温，每隔5min振荡 一次 （ 9）过滤（200目筛网）并收集滤液（含有单个的MEF） 二、实验方法与步骤 2.接种并进行原代培养 （1）细胞计数，按照1*105个/ml接种于培养瓶中 （2）48小时换液，4-5天后传代 3.传代培养 （1）传3-5代，并长满瓶底部，并换液备用于第 二天处理 4.丝裂霉素C处理细胞 （1）用20mg/L和10 mg/L以及空白组的丝裂霉 素C处理2.5-3.5小时 （2）弃去含有丝裂霉素C培养液 小鼠胚胎成纤维细胞显微图 体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞 二、实验方法与步骤 5.冲洗 （1）PBS冲洗3-6次，去除残余的丝裂霉素，加常 规培养液，在5天内用于步骤6 6.常规胰蛋白酶消化，重新接种，贴壁后即可以应用 （1）常规胰蛋白酶消化 （2）单细胞悬液以1*106个/ml接种于经过0.1%明 胶处理30min的培养瓶或者培养板中 （3）贴壁后即可以使用 四、注意事项 无菌操作 吹打细胞时要小心，用力均匀 用酶消化时注意时间，不可过渡 五、作业与思考 1.细胞计数，绘制MEF细胞生长曲线，连续7天，至少5天。分三个处理20mg/L和10 mg/L以及空白组 2.做好原代培养工作，并在48小时换液时和4-5天传代时，仔细观察细胞形态和生长状态并记录结果，分析产生结果的原因。 3.设计细胞培养室的理想布局，并且将仪器配备入内。 4.掌握细胞培养过程中的常用方法。 5. 如何尽可能的做到无菌操作 实验四 MS培养基的配制和愈伤组织诱导 一、实验目的 通过掌握MS培养基母液配制及常用培养基的制备和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件；掌握植物外植体的消毒技术、离体培养的无菌操作和愈伤组织诱导技术。 二、实验原理 植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基。 大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成。 二、实验原理 由于细胞的全能性，在合适的生长条件下，一定浓度的细胞分裂素和生长素配比可以诱导植物的外植体脱分化产生愈伤组织，为进一步再分化创造条件。 植物细胞全能性 三、实验材料与器具 高压灭菌锅、普通及精密天平、玻璃器皿（烧杯