腺病毒载体操作手册1407.docVIP

腺病毒载体操作手册 一、试验流程 制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培育基，培育十几天，在中间四五天左右更换一次新奇培育基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。 二、试验材料 （一）腺病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP和 pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。 1、载体信息 腺病毒克隆载体图谱如下： 各载体用途如下表： 腺病毒载体名称 干扰 pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP 过表达 pHBAd-CMV-IRES-GFP, pHBAd-CMV-IRES-RFP 标记示踪 pHBAd-CMV-IRES-GFP, pHBAd-CMV-IRES-RFP, pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP 2） 骨架质粒信息如下： 2、细胞株 293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依靠型成上皮样细胞，经培育生长增殖形成单层细胞,生长培育基为DMEM(含10% FBS)。 3、菌株 大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。 三、包装细胞293A细胞的培育 （一） 293A细胞的冻存 293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培育3~4个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。随着传代的次数增加，293A细胞会消失生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的消失，我们需要在开头就对细胞进行大量冻存，以保证明验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培育基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min后，镜下观看细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新奇培育基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将全部细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板 中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计 数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即 为实际 n万/mL 细胞浓度。 4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。 5、依据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培育基+20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为3 x 106个/ml。 6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。 7、其次天将细胞放于液氮罐中长期保存，并作纪录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观看细胞状态等。 （二）293A细胞的传代 当细胞生长到汇合率达到80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 1、消化细胞，方法同细胞冻存。 2、细胞离心结束后，加入完全培育基重悬。 3、依据具体状况，将细胞分到10cm培育皿中，每个培育皿补足到10ml培育基。 4、将培育皿平稳放回37℃、5%CO2和95%相对湿度的培育箱中培育。 （三）293A细胞的复苏 当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞消失污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。 1、设置温度为37~42℃的水浴。 2、查看细胞库纪录，依据纪录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），快速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 3、将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新奇的完全培育基，混匀后离心，1000rpm，5min。 4、去掉上清，加入5ml新奇的完全培育基，混匀沉淀后，转入6c