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外周血淋巴细胞染色体制备与分析技术规范 外周血染色体制备与分析技术规范原理： 在正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。植物血球凝集素（pha）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在pha作用下，原处于go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。利用pha这一特性，淋巴细胞经过含有hpa培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，例可得到所需的人体染色体图形。具有用血量少、操作简单等优点。 2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、液体、培育瓶、培养液（prmi1640、m199）、小牛血清、秋水仙素、kcl、甲醇、冰醋酸、载玻片等。 2、培养液配制 无菌条件下酿制培养液，每瓶所不含以下试剂：rpmi1640或19990% 小牛血清10% pha（自造）0.1ml3% 肝素10u/ml2% 双抗炎100u/ml（挑选） 分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封口置冷藏柜备用。 3、植物油凝素的制取 植物血凝素也称为植物凝集素（pha），可自制也可购自商品。自制的方法常用生理盐水提取法。 （a）干品制取法 （1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。恒温箱内24-48小时； （2）在无菌条件下切碎鸡子豆，提生理盐水30ml，容器后放进4℃冰箱24小时，第二天再提生理盐水70ml，再复置4℃冰箱内24小时。每8-12小时德帕伦一次。（也可以一次性提100ml生理盐水）； （3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用； （4）效价：外周血染色体制取每100ml培养基提pha约2ml。备注：若整个过程未在无菌条件下展开，灌装时用g5玻砂圆柱形除菌即可。 （b）鲜品制备法： （1）挑选完备并无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精煮沸10分钟； （2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口； （3）迁入4℃冰箱中置24小时，中间晃动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下灌装上清液于10ml大瓶内，复置冰箱冷藏层水泵。 （4）效价：正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。检查人染色体的数目、结构是否正常。 （1）标本类型：全血。 （2）标本要求：新鲜，无脂血，无溶血。 （3）标本退还状态：细菌污染，轻微甲状腺或脂血标本无法并作测量。 （1）采样接种：用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶盖，用酒精灯火焰过烤，无菌条件下抽取患者外周血0.5-1ml，每瓶加20滴左右，轻摇均匀，尽量避免培养物与瓶盖接触； （2）培育：复置36℃培养箱中培育72小时，内要12小时左右轻遥1次，以推动细胞生长细胞分裂； （3）抑止分裂：收获前2小时左右加秋水仙素，最终浓度为0.02ug/ml培养液，摇匀后置培养箱中继续培养，以抑止细胞在分裂中期。 （4）中止培育：从培养箱中抽出培育瓶，容器科玄珠至10ml尖底离心管中，尽量搜集培育细胞。2000rpm8分钟。 （5）低渗处理：弃上清液，加入预温37℃的0.075mkcl8ml，迅速打匀，置37℃培养箱或水浴锅中10-20分钟；（ 6）进度表紧固：抽出低渗中尖底离心管，轻轻重新加入崭新酿制的1-2ml3∶2甲醇：冰乙酸混合液，挑适当编号滴管用汽泡轻轻硬踢2-3之下。800-1000rpm8-10分钟； （7）固定：弃上清液。加入新鲜配制的3∶2甲醇冰乙酸混合液10ml，轻打混匀，封口置室温30分钟以上。1500-2000rpm10分钟，反复2-3次； （8）制片：采用蒸馏水制取冰水片展开滴片。领Vergt后结晶细胞，提新鲜酿制的紧固液，做成细胞悬液，挑1-2滴滴片，用作轻轻吹上开。刻号后清扫刻号污物，复置80℃烤片2小时； （9）收片：待烤箱自然冷却后，取出烤片，置干净环境中或培养箱中以备进行显带处理。