慢性肾小球肾炎动物模型制作及其形态学的改变.docxVIP

慢性肾小球肾炎动物模型制作及其形态学的改变 在我国北方是慢性肾小球肾炎疾病发病率较高的地区，近年来，随着人民的物质生活水平的不断提高，慢性肾小球肾炎的发病率占有相当大的比重。迄今为止，尚无十分有效的治疗，因此，研究其发病机制、防治措施具有重要意义。?　　本实验建立的动物模型可为临床治疗该疾病提供实验室动物实验模型条件。为临床研究新药物提供实验室可靠的理论依据。?　　1资料与方法?　　1．1实验材料雄性wistar大鼠中国医科大学动物室提供；luzex-f显微图像分析仪（日本，松下公司）；日立h-600透射电镜；恒冷箱切片机（日本）。?　　1．2实验动物分组本实验选用雄性wistar大鼠60只，体质量260~300g，随机分成3组。　　空白对照组：20只（`10只用于电镜染色，10只用于电镜观察）；慢性肾小球肾炎模型光镜组：60只；慢性肾小球肾炎模型电镜组：20只。?　　1．3实验方法?　　1．3．1经典慢性肾小球肾炎模型制备[1]①l型菌诱发选用家兔，急慢性肾小球肾炎患者3ml血，除去血浆，生理盐水洗3次，低渗盐水0．25%处理4h，0．2μm微孔滤膜负压抽滤，高渗肉汤或牛肉汤培养基与l型菌培养基生长的细菌收集。健康白兔2~2．5kg，1000万左右细菌耳缘静脉注入，隔日一次，共8次，30d后生肾炎;②静脉注射基底膜血清加脂多糖制基底膜抗原：balb/c小鼠200只，处死取肾皮质，在孔径105μm的不锈钢筛网上辗成匀浆后，用125μm，75μm滤膜重叠过滤，留存于75μm滤膜过滤的生理盐水中漂洗。收集后超声粉碎低温离心，沉淀于2ml生理盐水；抗血清制备：2ml抗原加4ml福氏完全佐剂，多点注射，3、5、6周同样方法强化，7周测滴度，1?∶?8时取血清。血清0．5ml，（1?∶?4稀释）小鼠尾静脉注射，24h后0．04mg脂多糖注射；③异种血清法雄性大鼠：福氏完全佐剂1mg和阳离子化牛血清白蛋白3mg（c-bsa等电点8．6）背部皮下多点注射为予免疫，两周后正式免疫；1、2周给c-bsa3mg，3~4周给c-bsa5mg，分别用ph704，0．01mol/lbsa稀释至1ml，1次/d，静脉注入。?　　1．3．2实验组慢性肾小球肾炎模型制备笔者将经典的慢性肾小球肾炎模型简化，选用雄性大鼠皮下注射：福氏完全佐剂1mg和同种大鼠肾组织的匀浆液0．5ml，1次/d。?　　1．3．3光镜组动物模型取材对实验动物用1%戊巴比妥钠（40ml/kg）腹腔麻醉后开胸，经左心室70滴/min滴入1%肝素钠的生理盐水500ml，同时剪开右心耳。继用0．1m磷酸盐缓冲液（pbs,ph=7．4）配制的固定液（含4%多聚甲醛）灌流固定。取出实验动物的大脑组织，放入含4%多聚甲醛的固定液中进行后固定大约2h，之后将实验动物的肾组织切成薄片移入含20%蔗糖的pbs中。在4℃冰箱中存放，至组织薄片沉底，经水包埋，恒冷箱连续横切片，片厚20μm。?　　1．3．4尼氏染色方法[2]冰冻切片吹干，经pbs漂洗5min×3次，将切片置入1%甲苯胺蓝溶液中37℃孵育90min，取出后用蒸馏水冲洗，pbs漂洗5min×3次，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。?　　1．3．5透射电镜组模型取材实验对照组大鼠在1%戊巴比妥钠（40ml/kg）腹腔麻醉下，经左心室灌注含1%肝素钠的生理盐水300ml快速冲洗后，用2%多聚甲醛及2．5%戊二醛的0．1mol磷酸缓冲液250ml灌流固定，灌流后立即取肾，将组织块置于4℃，2．5%戊二醛中固定24h，再经1%锇酸固定1h后，常规脱水，包埋，l.k.b超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，日立h-600透射电镜观察并拍片。?　　2实验结果?　　2．1尼氏染色结果在空白对照组切片中可见肾组织的细胞质呈蓝色，细胞形态正常，细胞数量较多，排列紧密，胞浆内尼氏体丰富；而在慢性肾小球肾炎模型光镜组中可见肾组织受损细胞，细胞数量减少，细胞排列紊乱，细胞形态改变，肿胀或皱缩，细胞坏死崩解，溶解成碎片。?　　2．2电镜超微结构观察在空白对照组切片中可见细胞的细胞膜、细胞核及细胞质中的细胞器均为正常；而在慢性肾小球肾炎模型电镜组中可见受损细胞出现明显的损伤性改变：核皱缩，核膜部分溶解消失、线粒体肿胀、嵴紊乱甚至缺失、线粒体出现空泡样变，内质网扩张、粗面内质网脱颗粒；高尔基复合体扩张，突触数量减少、前后膜融合、突触小泡不清或出现聚集。?　　3结论?　　根据尼氏染色和透射电镜结果证明慢性肾小球肾炎模型制备成功。该模型的制备不仅为基础医学研究提供了可靠的动物模型，更为药物临床治疗慢性肾小球肾炎提供可靠的实验室依据。该动物模型的建立成功，简化了以往经典的实验室动物模型的烦琐，更为简捷易操作，不仅节省实验费用，更为新药开展治疗慢性肾小球肾炎