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正常和肿瘤组织细胞培养 温医细胞生物学技术 正常和肿瘤组织细胞培养 内 容 正常组织细胞培养 上皮细胞的体外培养 不同组织细胞和器官的结构和功能、生长特性不同，在血管内皮细胞的体外培养 体外培养中所需的分离方法和生长条件也不同。 肾小管上皮细胞的培养巨噬细胞的培养 淋巴细胞的培养肿瘤细胞培养 上皮细胞的体外培养 上皮细胞的基本特征： 1.上皮组织的形态结构 2.上皮细胞的极性 3 . 上皮细胞间的连接 群体依赖性 接触抑制 贴壁依赖性细胞-贴壁生长 生长基质 体外培养的上皮组织细胞的生长生物学 形态学结构：均质性、透明性很强，结构不明显 体外培养上皮组织的生长与增殖特征 体外培养的特殊条件： 防范微生物污染：根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及培养基等需添加抗生素，抗生素浓度比其它组织培养高。 生长基质的支持：皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。在培养器皿表面包被生 长基质，如胶原或其它细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞极性表现更为明显。 特殊的培养基 M199 RPMI1640 DMEM Fam F12（无血清培养基）：M199 和 RPMI1640 培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。DMEM 和 HamFl2 培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。HamFl2 培养基的特殊性特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。在实际培养时，将 DMEM 与 HamFl2 按一定比例混合用于上皮组织培养。 去成纤维细胞：上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的“细胞污染源”。因此在上皮细胞的取材、分离、种植和 传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细胞的生长。 体外培养上皮细胞的形态学变化体外培养上皮组织细胞的观察与检测 一般形态学观察 组织化学与免疫组织化学观察与检测酶类：碱性磷酸酶、琥珀酸脱氢酶 特异性抗原标记物：角蛋白、上皮细胞膜抗原、VIII 因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白血管内皮细胞的体外培养 人脐静脉内皮细胞的培养 1.主要材料：组织来源：婴儿脐带 培养用液： M199+20%FCS、D-Hanks、0.1%胶原酶溶液2.培养方法：分离细胞培养法 1 正常和肿瘤组织细胞培养 温医细胞生物学技术 ). 将 15-20cm 长的新生儿脐带放入无菌的 PBS 溶液中储存。（注：4℃下最多贮存 24 小时，室温下不超过6 小时，否则废弃） ). 用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的 PBS 溶液冲洗 3-5 次，将污血冲洗干净为止。 ). 用手术钳夹紧脐带下端，加入 15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化 15-20 分钟，并不时上下摇动脐带。 ). 消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个 50 ml 无菌离心管中，用无菌的 PBS 溶液冲洗脐带 2-3 次。 ). 将收集液离心（2000 转/分）3 分钟，去上清，加入 RPMI1640 培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置 CO2 培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。肾小管上皮细胞的培养 原代培养：切取 1cm3 外层肾皮质、剪碎成 1mm3→ 80 目研磨冲洗、于 100 目上收集肾小管节段→0.2%胰蛋白酶消 化、调整细胞数→接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养→每隔 3~4 天，更换培养液 传代培养： 培养结果： 3d 长出细胞 5~7d 进入对数生长期 7~9d 融合成单细胞层 鉴定：抗角蛋白抗体染色（+） 巨噬细胞的培养 获取巨噬细胞的方法 （一）肺泡巨噬细胞：支气管肺泡灌洗法、支气管镜肺泡灌洗法 （二）腹腔巨噬细胞：实验动物: 6 周龄小鼠、培养液：10%FCS RPMI1640 巨噬细胞的纯化 1、原理：巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点 2、方法：用帖壁法纯化巨噬细胞，用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞淋巴细胞的培养 各类淋巴细胞的主要特征 T 淋巴细胞：表面标志：1.表面受体：TCR、SRBC R、Fc R 、MR、Measl