分子肿瘤学基础.pptxVIP

毒理学教研室 徐德祥;第一章 绪论;一、肿瘤发病的流行病学现状;二、 肿瘤发病机制的研究进展;肿瘤的多因素多阶段多基因参与的过程;肿瘤的发病与体细胞突变有关;抑癌基因：纯合缺失或失活而引起恶性转化的基因 二次突变学说（Rb基因，视网膜母细胞瘤） 遗传性视网膜母细胞瘤患者（Rb等位基因突变或缺失）： 一次突变引起发病 非遗传性视网膜母细胞瘤： 二次突变突变引起发病;肿瘤易感性和易感基因;三、肿瘤的分子诊断及其研究进展; （3） 肿瘤的早期诊断 （4） 肿瘤的预后判断：从分子水平上判断肿瘤的良、恶性及预后，有较高的准确性。肿瘤相关基因的突变、扩增及过表达等常与预后密切相关。 （5） 肿瘤的个体化和预见性治疗:肿瘤的发生是多基因、多步骤、多阶段的过程，在发生、发展的不同时期，可能涉及不同的基因和不同的变化形式，而基因的变化和基因间的信号传递与肿瘤临床治疗的敏感性密切相关。提供肿瘤基因变化，对治疗有指导意义。 （6） 肿瘤的预后监测 ; 2、肿瘤基因过表达及其检测 ; （2）基因过表达的检测 ①表达产物的检测：几乎所有被克隆的癌基因、抑癌基因都有相应抗体，其中大多数已商品化。 免疫组化（immunohistochemistry） 酶联免疫吸附实验（ELISA） 免疫沉淀法：检测并定量分析蛋白质混合物中的靶抗原敏感（可检出100pg的放射性标记蛋白）。与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并用，可用于分析外源基因在原核和真核宿主细胞中的表达。;蛋白印迹法（Western blot）：70年代末80年代初，在蛋白质凝胶电泳（分辨率高）和固相免疫测定（特异敏感）的基础上发展的，结合了二者优点，无需同位素标记，具有从混杂抗原中检出特定抗原，或从多克隆抗体中检出单克隆抗体的优势，还可对转移到固相膜上的蛋白进行连续分析，有蛋白质反应均一性、固相膜保存时间长等优点。敏感性为1～5ng。 细胞裂解—→SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳→蛋白质电转移→封闭→加一抗→加二抗→显色照像。 流式细胞仪（flow cytometry）测试法：用荧光标记抗体与含有特异抗原的细胞结合，用流式细胞仪对含不同荧光信号的细胞分类测试，可检测细胞表面受体、标志物或特异性蛋白及细胞的分类分析。;②基因扩增的检测：肿瘤基因扩增可产生过量的表达蛋白，也可表现为基因拷贝数增加和转录产物mRNA增加。 经典检测方法为核酸分子杂交，包括原位杂交（in situ hydridization，ISH）、荧光原位杂交（FISH）、DNA杂交（Southern blot）、RNA杂交（Northern blot）、原位PCR、逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）。 FISH 将荧光素标记克隆的DNA片段与染色体或细胞间期染色质杂交，以测定特定的DNA片段是否有缺失或扩增。 原位PCR：结合了PCR与ISH技术优点，在组织切片或细胞涂片上原位对特定DNA或RNA进行扩增，再用特异性探针作原位杂交检测，以达到对靶核苷酸进行定性、定位、定量分析。 逆转录PCR（RT-PCR） 用来扩增从RNA分子中得到的一段特异序列。RNA首先被逆转录为cDNA。用位于一段特异序列或一个基因两侧的引物生成以cDNA为模板的PCR产物，得到阳性产物说明存在特异性的RNA序列。为扩增从mRNA逆转录的cDNA，引物中应含一段目的基因的内含子区，以使从带有基因组DNA的PCR产物中区分出cDNA的PCR产物。经典方法包括RT和PCR两步。 ;（3）肿瘤基因差异表达的检测 控制生物性状的基本结构和功能单位是基因，不同细胞或同一细胞的不同时间与空间基因表达的差异决定着生命活动的多样性，如发育、分化、繁殖、细胞周期调控、衰老、死亡等。实际上，细胞的各种生理过程或病理改变本质上都是由基因表达的改变所决定的。因此获取差异表达的基因将有助于了解正常生理变化和病理改变的分子机制，为基因诊断、基因治疗和发现新的药物靶分子提供新的视野。  ;① DD-PCR（differential display PCR）又称差异显示反转录PCR（DDRT-PCR） 简要流程 对照组 处理组 ↓……反转录…… ↓ mRNA或总RNA mRNA或总RNA ↓ ……PCR………. ↓