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会计学 1 细胞转染技术宋晓萍 目录 1 影响转染实验的因素 转染方法 第1页/共36页 将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。 细胞转染—— 研究内容：研究和控制真核细胞基因功能 应     用：基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验 第2页/共36页 常规转染技术 瞬时转染 外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小，大约 1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素 B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 稳定转染 外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果， 常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。 第3页/共36页 第4页/共36页 脂质体介导转染 脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内。 第5页/共36页 1.  promega公司   Promega转染试剂产品适合于人HeLa，Hep G2，293，K562，Jurkat；猴COS-7，CV-1；小鼠NIH3T3；仓鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆虫S19等等细胞系的RNAi转染。   2.  Invitrogen公司   Lipofetamine2000，适合于Hela，BHK，HEK，COS-7，PC12，NIH3T3等各种常用细胞系的RNAi转染。   3.  转染FAQs： 转染试剂的选择 脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。 悬浮细胞是用的电穿孔法。 第6页/共36页 质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。 将细菌质粒转化到大肠杆菌中，然后从大肠杆菌中收获大量质粒的过程。 ——将质粒 DNA 导入细菌的过程 1、质粒的转化 感受态细菌细胞在 CaCl 2 低渗溶液中膨胀为球状（感受态细菌的制备，略）。质粒 DNA 与 CaCl 2 形成抗 DNase 羟基 - 磷酸钙复合物黏附于细菌表面，经 42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，外源基因得到表达。 BL21(DE3)一般用于外源基因的原核表达， DH5a，TG1和HB2151一般用于重组质粒的克隆和扩增 TG1长得慢，菌落较小，转化效率高，用于普通的克隆测序，BL21(DE3)长的快，菌落较大，转化效率低点，主要用于原核表达。 第7页/共36页 感受态细菌细胞 特点 用途 TG1 长得慢，菌落较小，转化效率高， 用于普通的克隆测序 DH5a E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 常用于分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 BL21(DE3) 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。长的快，菌落较大，转化效率低点。 一般用于外源基因的原核表达 JM109 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 第8页/共36页 细菌铺板：加入抗生素（终浓度是50ug/ml-100ug/ml） 挑选菌落：从LB培养基上挑选菌落备用 细菌培养：37摄氏度培养箱中以180rpm摇动12~14h，使大肠杆菌繁殖 碱裂解抽提：采用细胞裂解的方式，从含目标质粒的大肠杆菌菌液中将质粒提取出来 2、质粒的提取扩增 质粒的转化具体方法省略…… NOTE: 不同的感受态细菌转化效率不同，选择合适的E.coli 1ng的cccDNA就可使50ul的感受态细胞饱和，DNA量过多会降低转化效率。 转化时为提高转化效率，质粒加入E.coli培养1h后可离心弃上清后用剩余的菌液涂布。 第9页/共36页 在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原