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紫外检测 蛋白凝胶层析法会计学第1页/共96页4.凝胶层析的应用范围有那几方面？5.凝胶层析有何优缺点？6.常用凝胶分那几类？分别叙述它们各自的应用范围及特点。7.在实验中应如何选择凝胶与预处理？8.细粒凝胶柱流速慢，洗脱峰越窄，分辨率高，适用于什么产品多分离或分析？粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，适用于产品制备那个阶段的分离？第2页/共96页9.什么是“类分离”和“分级分离 ”？10.在凝胶层析中要想得到好的层析结果应注意那些问题和采取那些措施？11.凝胶用过后，有那几种保存方法？12.葡聚糖凝胶离子交换剂，葡聚糖凝胶和离子交换剂有何异同及特点？第3页/共96页凝胶层析（gel chromatography）常出现多种名称 ： 如凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。凝胶层析的定义： 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。第4页/共96页凝胶层析的应用范围： 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。凝胶层析的优点 凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。第5页/共96页 －、凝胶层析的基本原理 凝胶层析的原理 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中第6页/共96页 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另 第7页/共96页一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。 Vt=Vo+Vi+Vg Vt=πR2h第8页/共96页 V。简称为外水体积，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，即可测出柱床的外水体积Vo。 Vi简称内水体积，可由g·Wr求得（g为干凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL／g表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积Ve计算，即 Ve＝Vo＋Vi第9页/共96页 对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和Vi之间的关系可用下式表示： Ve＝Vo＋Kd.Vi 式中Ve为脱体积，它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。Kd为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特定的分配系数，它只与被分离物质分子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。 第10页/共96页 Ve＝Vo＋Kd.Vi可改写为： （Ve-Vo） Kd=－－－－ Vi当Kd＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来；第11页/共96页当Kd＝1时，即Ve小分子 ＝Vo＋KdVi，说明这种溶质的相对分子质量小，完全向凝胶颗粒内扩散，在洗脱过程中将最后流出柱外。 但实际上，约有1/5的内水因溶剂化作用而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上Ve小分子 ＝Vo＋0.8Vi；当0＜Kd＜l时，意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散，Kd愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；Kd＝0.5时，其洗脱体积Ve＝Vo十0.5Vi。 型号VtV0ViG-1020.81G-1531.11.5G-25522.5G-501045G-751357G12页/共96页 不同型号葡聚糖凝胶柱床参数第13页/共96页二、凝胶层析的特点 1．凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。 2．分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100％。 第14页/共96页3．分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物