DNA重组技术的基本工具罗静瑜）-完整版PPT课件.ppt

实现基因工程对生物的改造最少需要三种工具： （1）DNA的“手术刀”：限制性核酸内切酶； （2）DNA片段的“缝合针”：DNA连接酶； （3）导入DNA的“运输工具”：质粒等。 第一节 DNA重组技术的基本工具 限制性核酸内切酶－－简称限制酶 来源：主要从原核生物中分离纯化 思考：该类酶在原核生物中的作用是什么？ 识别序列：大多识别6个核苷酸组成的序列，少数能 识别由4、5或8个核苷酸组成的序列 作用：识别特定核苷酸序列，断裂核苷酸之间的 磷酸二酯键 切割产物：（1）黏性末端；（2）平末端。 DNA连接酶 名称 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 作用 缝合双链DNA片段，恢复核苷酸之间的 磷酸二酯键 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 性质 连接黏性末端 连接黏性末端或 平末端（效率较低） DNA连接酶 DNA聚合酶 对象 连接DNA片段与DNA片段 连接DNA片段与单个脱氧核苷酸 模板 连接片段间的缺口，不需要模板 以一条DNA链为模板 DNA连接酶和DNA聚合酶的比较 基因进入受体细胞的载体：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒 基因工程载体必须满足以下条件： （1）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因可以 插入到载体上； （2）载体DNA必须具备自我复制能力或随受体DNA的复制而同步复制； （3）载体DNA需带有标记基因，以便重组后进行筛选； （如：抗四环素、氨苄青霉素等） （4）载体DNA必须是安全的； （5）载体DNA必须大小适合，以便提取以及在体外进行操作。 在进行基因工程的操作中，真正被作为载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 第二节 基因程序工程的基本操作 （1）目的基因的获取 （2）基因表达载体的构建 （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测与鉴定 求异思维：mRNA如何反转录形成cDNA？ （1）在反转录酶的作用下，以mRNA链为模板，合成与之互补 的DNA链，形成mRNA－DNA杂交分子； （2）核酸酶H使mRNA－DNA杂交分子中的mRNA链降解， 形成单链DNA； （3）以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成互补的 DNA链，形成双链DNA分子。 目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。 基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中通过克隆而储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。 基因：有遗传控制效应的DNA 片段，是控制性状的遗传物质的基本结构和功能单位，基因的脱氧核苷酸序列代表遗传信息。 基因组文库：含有某种生物所有基因的基因文库。 获取目的基因的方法： （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增目的基因 PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，可以获取大量的目的基因。 PCR的扩增过程： （1）将反应体系（双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90－95℃，使双链DNA模板间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板； （2）将反应体系降温到55－60℃使两种引物分别与DNA链的互补序列互补配对，这个过程称为复性； （3）将反应体系升温至70－75℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3－OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA单链。 随着重复次数的增多，DNA分子以2n的形式增加。 基因表达载体的构建：基因工程的核心 一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因。 启动子、终止子以及标记基因的相关作用。 目的基因的导入 （1）导入植物细胞： （a）农杆菌转化法： 原理：农杆菌在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，其Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的DNA上。 （c）花粉管通道： 原理：在植物授粉后，花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 （b）基因枪法： 原理：利用压缩气体产生动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达。 （2）导入动物细胞 显微注射法：将目的基因注入卵细胞，再将该受精卵移植到雌性动物的输卵