小鼠肾脏细胞系的建立.docx

小鼠肾脏细胞系的建立 细胞工程实验方案 设计题目：小鼠肾脏上皮细胞系的建立 设计者：班级 生物 1101 姓名 马聪冲学号 指导教师： 日 期： 2013 年 11 月 11 日 西南科技大学 生命科学与工程学院 目 录 一、基本原理 （一）基本概念 二、准备工作 （一）实验所需试剂与材料 （二）实验所需的器材与设备 （三）基本用液的配置 （四）器材清洗、干燥与消毒 三、实验步骤 （一）取材 （二）原代培养 （三）传代培养 （四）细胞纯化 （五）细胞系的建立 （六）细胞冷冻保存 （七）冻存细胞的复苏 四、注意事项 小鼠肾脏上皮细胞系的建立 — 基本原理 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。这个实验方案就是选取小鼠肾脏上皮利用动物细胞培养技术建立细胞系。 二 准备工作 实验所需的试剂与材料 健康小鼠、火柴、酒精灯、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、 EDTA、稀盐酸、蒸馏水、20%新洁尔灭、70%乙醇、D-Hanks 液、甲醛、高锰酸钾、甘油、滤纸、0.22 滤膜、台盼蓝、培养基成分（见表） 实验所需器材与设备 培养皿、镊子、手术刀、手术剪刀、小烧杯、吸管、三角瓶、棉球、细胞计数板、滤器、毛刷、超净工作台、紫外灯、液氮、冻存管、溶液瓶、量筒、毛帕、 脸盆、一次性手套 基本用液的配置 RPMI-1640 培养基的制备与消毒 序 化合物名 序 化合物名 含量 序 号 1 称 (mg/L) 号 2 L-精氨酸 290.00 21 L-门冬酰 50.00 22 胺 L-门冬氨 20.00 23 酸 L-胱氨酸 65.15 24 二盐酸盐 化合物名 称 硝酸钙 无水硫酸镁 无水磷酸 二氢钠 含量 (mg/L) 100.00 48.84 3 676.13 4 氯化钾 400.00 7 L-组氨酸 15.00 27 L-羟脯氨  5 L-谷氨酸20.0025 5 L-谷氨酸 20.00 25 氯化钠 6 甘氨酸 10.00 26 葡萄糖 6000.0 0 2000.0 0 1.00 8 20.00 28 酚红 酸 L-异亮氨 L-谷氨酰 5.00 9 50.00 29 300.00 酸 胺 10 L-亮氨酸 50.00 30 生物素 0.20 L-赖氨酸 11 40.00 31 D-泛酸钙 0.25 盐酸盐 L-甲硫氨 12 15.00 32 叶酸 酸 L-苯丙氨 1.00 13 15.00 33 i- 肌醇 35.00 酸 14 L-脯氨酸 20.00 34 烟酰胺 1.00 15 L-丝氨酸 30.00 35 氯化胆碱 3.00 盐酸吡哆 16 L-苏氨酸 20.00 36 醇 1.00 17 L-色氨酸 17 L-色氨酸 5.00 37 18 L-酪氨酸 23.19 38 核黄素 盐酸硫胺素 维生素 B 12 0.20 1.00 19 L-缬氨酸 20.00 39 0.005 20 对氨基苯 甲酸 1.00 常用的培养基灭菌方法有化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、过滤灭 菌。因为化学药剂与培养基的一些成分作用，所以不采用；因为紫外线的穿透 能力弱，所以仅用于表面消毒和空气的消毒。所以本次实验采用湿热灭菌 D-Hanks 液的配制： 1）溶解定容：将药品（NaCl：4.0g，KCl：0.2g，Na2HPO4·12H2O：0.06g，KH2PO4： g， NaHCO3：0.15g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解， 然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 500ml，摇匀即成新配制的 D-Hanks 溶液。2）移入溶液瓶内待消毒：将D-Hanks 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽， 并插上针头放入高压锅内 8 磅消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 0.02%EDTA 溶液的配置： EDTA0.20g、Nacl8.00g、KCl0.20g、葡萄糖 2.00g、0.5%酚红 4ml，加入蒸馏水定容至 1000ml。10 磅 20min 高压灭菌，使用时调节 PH 值到 7.4。 胰蛋白溶液: 用少量的 D-Hanks 液把胰蛋白酶粉末调成糊状 补足 D-Hanks 液，震荡摇匀，置 4℃冰箱内过夜 次日，等胰蛋白酶溶解后用滤纸过滤 滤纸再经过 0.22 滤膜除菌 分装小瓶放到冰箱内低温保存 使用时，用 NaHCO 调节至 PH7.0 左右 3 %台盼蓝母液： 称取 4 克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至 100ml，用滤纸过滤，4℃ 保存。 器械清洗、干燥与消毒 （1）常用的器械消毒方法大概分为两类，一类是物理灭菌，主要包括湿热灭 菌、过滤