DB33_T 2268-2020猫细小病毒 PCR 检测方法.docxVIP

ICS 11.220 B 41 DB33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2268—2020 猫细小病毒 PCR 检测方法 PCR detection technique for feline panleukopenia virus 2020 - 06 - 30 发布 2020 - 07 - 30 实施 浙江省市场监督管理局 发 布 DB33/T 2268 DB33/T 2268—2020 I I 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009的规定编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：张红丽、徐 辉、赵灵燕、周彩琴、吴贇竑、黄 靖、吕见涛、刘爱军、刘 霞、吴雪军、孙冰冰、章杭建。 DB33/T 2268 DB33/T 2268—2020 DB33/T 2268 DB33/T 2268—2020 PAGE PAGE 1 2 2 猫细小病毒 PCR 检测方法 范围 本标准规定了猫细小病毒PCR（polymerase chain reaction）的实验条件、操作步骤、结果判定。本标准适用于猫细小病毒（猫泛白细胞减少症病毒）的检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猫细小病毒 Feline panleukopenia virus，FPLV 属细小病毒科，细小病毒亚科，牛犬细小病毒属成员，又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性胃肠炎病毒或猫瘟病毒。 实验条件 试剂 要求 除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为符合GB/T 6682要求的灭菌双蒸水或超纯水。 试剂 核糖核酸酶（20 mg/mL）。 10%十二烷基磺酸钠溶液。 10 mg/mL 蛋白酶 K。 Tris-盐酸饱和酚（pH 7.6）。 酚-氯仿-异戊醇混合液（25：24：1）：在一灭菌棕色瓶中按 25：24：1 比例分别加入酚、氯仿、异戊醇。 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.4）。 琼脂糖。 10 μg/μL 溴化乙锭（ethidium bromide， EB）：溴化乙锭 20 mg、加灭菌双蒸水至 20 mL 充分溶解混匀而成。 50×TAE 缓冲液：羟基甲基氨基甲烷（Tris）242 g、冰乙酸 57.1 mL、0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）100 mL，加灭菌双蒸水至 1 000 mL 充分混匀。 加样缓冲液：聚蔗糖 25 g、溴酚蓝 0.1 g、二甲苯青 0.1 g，加灭菌双蒸水至 100 mL 充分溶解混匀而成。 2.5 mmol dNTPs（deoxyribonucleoside triphosphates，脱氧核糖核苷三磷酸）。 10×PCR Buffer。 DNA 分子量标准：DL2000。 引物序列 FPLV-F：5—CCAGCTGAGGTTGGTTATAGTG—3；FPLV-R：5—GGTGCATTTACATGAAGTCTT GG—3。 仪器设备 高速冷冻离心机：要求最大离心力在 12 000?rpm 以上。 PCR 扩增仪。 核酸电泳仪和水平电泳槽。 微波炉。 分析天平。 恒温水浴锅。 冷藏冰箱和低温冷冻冰箱。 微量移液器。 凝胶成像系统（或紫外透射仪）。 高压灭菌锅。 超净工作台或生物安全柜。 操作步骤 样品的采集和处理 采集动物粪便、肛拭子、全血或肠道等组织样品并进行处理: 肛拭子、粪便（加适量 PBS）等样品经 4 ℃ 5 000 rpm/min 离心 2 min，取上清液； 全血样品待血凝后经 5 000 rpm/min 离心 2 min，取血清； 取 0.1 g 肠道等样品与灭菌 PBS（全称、浓度）按 1：5 的重量体积比制成悬液，匀浆后，反复冻融 3 次，在涡旋混合器上混匀后经 4 ℃ 5 000 rpm/min 离心 10 min，取上清液。 制备的样品在 2 ℃～8 ℃保存时间不应超过 24 h，长期保存应分装成小管，置于-20 ℃以下，避免反复冻融。 DNA 的提取 设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为猫细小病毒阳性样品，阴性对照为灭菌双蒸水。 按下列步骤完成DNA 的提取，也可选择市售商品化 DNA 提取试剂盒，完成DNA 的提取： 取 1.5 mL 灭菌离心管，加入处理样品 5.1.1 上清液 400 μL 和 30 μL（20 mg/mL）核糖核酸酶， 混匀后，室温下作用 20 min； 加入 43 μL 10%的十二烷基磺酸钠溶液