高氧肺损伤中肺细胞凋亡及JNK信号通路调控机制.docVIP

高氧肺损伤中肺细胞凋亡及JNK信号通路调控机制 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：高氧肺损伤中肺细胞凋亡及JNK信号通路调控机制 1 1材料和方法 2 1.2方法 2 文2：高氧肺损伤中肺细胞凋亡及JNK信号通路调控机制 6 1材料和方法 6 1.2方法 7 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 高氧肺损伤中肺细胞凋亡及JNK信号通路调控机制 文1：高氧肺损伤中肺细胞凋亡及JNK信号通路调控机制 0引言 氧疗是临床上用于改善组织缺氧状态的一种常用治疗手段，然而长时间持续吸入高浓度氧，可致活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量产生，导致肺氧化应激性损伤［1-2］. 近年来研究［1-3］表明细胞凋亡可能是高氧肺损伤的一个重要组织学特点. cJun氨基末端激酶(CJun NH2terminal kinase，JNK)信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶(motigenactivated protein kinases，MAPKs)家族中的重要通路之一［4］，其在体内是否参与了高氧肺损伤的发病机制并介导高氧诱导的肺细胞凋亡，目前还少见报道. 我们以幼年Wistar大鼠为研究对象，观察高氧下肺组织细胞凋亡及磷酸化JNK(pJNK)蛋白表达的变化，以探讨JNK信号转导通路对高氧诱导的肺细胞凋亡的调控机制. 1材料和方法 1.1材料清洁级3 wk龄Wistar大鼠48只,体质量40～50 g，雌雄不限（重庆医科大学动物中心提供）. 原位细胞凋亡检测试剂盒（德国Roche公司）；SP600125(美国Sigma公司)；pJNK兔多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mAb（上海康成生物工程有限公司）；powervisionTM twostep 免疫组化检测试剂盒和辣根过氧化酶（HRP）标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；二辛可宁酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（BioRad公司）；增强化学发光法（ECL）试剂盒（美国Pierce化学品公司） 1.2方法 1.2.1动物分组及高氧模型制备采用随机数字表法将48只大鼠分为空气对照组、高氧暴露3，7，14 d组、空气＋JNK抑制剂干预组、高氧暴露7 d＋JNK抑制剂干预组6组（n=8）. 将高氧组置于有机玻璃氧仓中，连续行吸入氧体积分数（FiO2）监测，保证FiO2≥950 mL/L；空气对照组置于同室空气中（FiO2=210 mL/L）；JNK抑制剂SP600125干预组动物经腹腔注射SP600125 30 mg/kg，药物一次性给予，给药2 h后予高氧或空气暴露7 d. 各组环境温度控制在21℃～25℃，湿度50%～60%, 并于每日09∶00开箱10 min，清洁有机玻璃氧仓，添加饲料及饮水. 1.2.2标本采集空气对照组（空气暴露第7日取标本）、高氧暴露组（分别在高氧暴露第3，7，14日取标本）、JNK抑制剂干预组（分别在干预后再空气暴露和高氧暴露第7日取标本）动物以35 mL/L水合氯醛（10 mL/kg）腹腔麻醉，开胸，结扎右中肺，剪左心耳，于右心室注入含肝素的生理盐水灌洗肺循环血管，直到左心房流出的液体清亮为止. 分离肺组织，生理盐水漂洗干净，滤纸吸干水分，右中肺经40 g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm切片，HE染色，光镜下检查肺组织病理变化；同时行细胞凋亡检测及免疫组化检测. 其余部分置于-70℃冰箱保存，行pJNK Western Blot检测. 1.2.3肺组织细胞凋亡检测采用TUNEL检测. 切片脱蜡至水，加入蛋白酶K工作液，21℃～37℃反应15～30 min，30 mL/L H2O2室温下（15℃～25℃）封闭10 min，滴加50 μL TUNEL反应混合液（酶反应液与标记液的比例为1∶9）湿盒中37℃避光湿润反应1 h，再滴加50 μL ConverterPOD,湿盒中37℃避光湿润反应30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片. 结果判断和图像分析： 胞核呈现棕黄色为阳性细胞. 每张切片随机选5个高倍镜(×400)非重叠视野，应用北航病理真彩色图像软件分析系统CM2000B，记数每个视野的凋亡指数（阳性细胞数/总细胞数×100％），再求均值. 1.2.4pJNK在肺组织中表达和分布的检测采用二步法免疫组化检测. 切片脱蜡至水，30 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶5～10 min，热修复抗原，血清封闭20 min，滴加