DNA定点突变实验具体步骤及详细说明.docx

DNA定点突变实验具体步骤及详细说明 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。 一、引物设计每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45 bp，设计的突变位点需位于引物中部。 ? 二、反应1. ?使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。 ? 2. ?反应体系： ? （1）10x pyrobest Buffer： 5 ul ? （2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul ? （3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul ? （4）primer 1 (125 ng) ：1 ul ? （5）primer 2 (125 ng) ：1 ul ? （6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul ? （7）加无菌蒸馏水至50ul. ? 三、产物沉淀纯化1. ?加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20℃冰箱）5min，离心弃上清。 2. ?70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中（此步可省略，直接用 DpnI酶切）。? 四、DpnI酶切1. ?酶切体系（1）Buffer ：2 ul ? （2）BSA（100x）：0.2 ul ? （3）DNA ：x ul ? （4）DpnI：0.5 ul ? （5）加无菌去离子水至 20 ul。 ? 2. ?30℃酶切 1~4 h。3. ?65℃水浴15min 终止反应。 ? 五、转化将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。 ? 六、测序验证 注意事项 1. ?引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。 ? 2. ?Quick change试剂盒分为几种不同的类型，QuikChange?、Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange?、 XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。 ? 3. ?DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。 ? 4. ?实验板长出来的菌有两种可能，一种是质粒DPNI没处理干净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的（突变体），不过这两种菌长得一模一样，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无法区分），除了测序，是分不出来的。5. ?做PCR时也最好做一个负对照（不加引物），实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对照管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前里面只有模板。如果两者都拿去DNPI处理，就能够证明模板已经被去除干净。若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。如果出现正负对照都长菌，那么就是DpnI没处理好，如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。 经验 一、经验分享 1. ?实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做： ? 第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。 ? 大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。 ? 第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信