二维电泳的蛋白质提取与样品制备.pptVIP

8、不溶物质 阻碍凝胶孔径，导致聚焦不良 阻碍蛋白进人IPG胶条 先除去不溶物质 第30页，共50页。 六、裂解液的组分 基本成分：尿素、一种或几种去污剂 尿素：中性离液剂，可溶解和解折叠大多数蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中 去污剂：确保蛋白完全溶解，防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合 还原剂：断裂二硫键，以保持蛋白处于一种还原状态 载体两性电解质、IPG buffer:通过电荷与电荷之间的相互作用减少蛋白聚合以增加溶解性 第31页，共50页。 1、可溶性样品 血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物，经很少的前处理便可进行2-DE 蛋白质浓度较高的样品，适量样品裂解缓冲液稀释后直接分析 较低的蛋白质浓度或较高盐浓度的样品，可透析或液相色谱脱盐，通过冻干、聚乙二醇的透析、超滤、TCA/丙酮沉淀浓缩样品 导致蛋白酶失活，进而减少蛋白质降解，去除杂质、富集碱性蛋白质 七、样品制备 第32页，共50页。 2、组织样品 组织在液氮中冷冻后破碎 组织样品的异质性 免疫亲和技术 激光捕获微量切割技术（LCM） 第33页，共50页。 3、细胞 体外悬浮培养细胞或周期性细胞样品：离心收集，随后用磷酸盐缓冲液清洗并溶于样品缓冲液 固体基质中培养的细胞：去除培养基质，PBS或等渗蔗糖溶液清洗细胞层，刮擦方法收获细胞，避免使用蛋白裂解酶；或加入少量体积裂解缓冲液，将附着在基质上的细胞直接裂解 核酸含量过高，用不含蛋白酶的DNase/RNase混合物来处理样品 第34页，共50页。 4、样品分级 目的：降低样品的复杂性并富集低拷贝蛋白质 亚细胞收集、液相电泳、吸附色谱、选择性沉淀 蛋白质在一系列溶解能力逐渐增强的缓冲液中溶解性能的不同 第35页，共50页。 * * 第三章二维电泳的蛋白质提取与样品制备 第1页，共50页。 制备目的 完全溶解 解离 变性 还原蛋白 选择细胞破碎方法、蛋白解聚、溶解方法、去污剂和裂解液的成分 第2页，共50页。 样品制备原则 尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解 样品裂解液应该制备，并且分装冻存-80℃，勿反复冻融已制备好的样品 通过超速离心清除所有的杂质 加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白 第3页，共50页。 第一节细胞裂解方法 温和裂解方法 剧烈裂解方法 用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 蛋白沉淀步骤 清除影响二维电泳图谱杂质 裂解液组分 第4页，共50页。 一、温和裂解法 组成较简单样品 渗透裂解 血细胞、组织培养细胞 低渗溶液悬浮细胞 冻融裂解 细菌、组织培养细胞 液氮迅速冷冻细胞，随后在37 ℃融化，反复几次 第5页，共50页。 去污剂裂解 组织细胞 溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物 酶裂解法 消化细胞壁 溶菌酶 细菌 纤维素酶、果胶酶 植物 溶细胞酶 酵母 在等渗溶液中处理细胞 第6页，共50页。 二、剧烈裂解法 超声裂解法 细胞样品 通过切应力裂解细胞 迅速超声重悬细胞，并在冰上冷却 弗氏压碎器（French Pressure cell） 含有细胞壁的微生物 在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力 第7页，共50页。 研磨法 固体组织、微生物 冻存于液氮中，随后研磨成粉末 机械匀浆法 固体组织 将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，简单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液 玻璃珠匀浆法 细胞悬液、微生物 剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁 第8页，共50页。 三、蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 蛋白酶抑制剂鸡尾酒（protease inhibitor cocktail） 苯甲基磺酰氟 (Pheylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)：不可逆的抑制剂，使用浓度为1mmol/L?，抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中迅速失活 AEBSF ：丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L?，AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低，AEBSF可能改变蛋白的等电点 第9页，共50页。 EDTA，EGTA：使用浓度为1mmol/L，通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。 多肽蛋白酶抑制剂：使用浓度为2-20ug/ml ? 亮抑酶肽（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑酶肽（aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基多肽酶 第10页，共50页。 甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCk），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPC）K：使用浓度为0.1-0