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柱色谱分离实验会计学第1页/共39页一、实 验 目 的了 解： 1. 柱色谱法分离有机物的原理。 2．固定相和流动相的选择原则。掌 握： 1. 色谱柱的填充方法。 2．柱色谱分离的基本操作。第2页/共39页色 谱 法 简 介 色谱法亦称色层法，层析法等，是分离，纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一，还可定量分析。 液—固色谱法气—固色谱法固定相、流动相的物理状态气—液色谱法液—液色谱法柱色谱法（column chromatography）纸色谱法（paper chromatography）操作形式薄层色谱法（TLC）气相色谱（GC）高效液相色谱（HPLC）吸附色谱法分配色谱法分离原理离子交换色谱法排阻色谱第3页/共39页二、实 验 原 理柱色谱法（column chromatography）色谱法分类操作形式第4页/共39页洗脱剂(流动相)混合物吸附剂(固定相)柱色谱分离示意图第5页/共39页二、实 验 原 理第6页/共39页第7页/共39页二、实 验 原 理影响分离效果主要因素洗脱剂的极性：溶解度适中、不反应、易获取回收化合物的结构：化合物的吸附性和它们的极性成正比吸附剂的性质：均匀、表面积大、不反应、吸附能力不同第8页/共39页第9页/共39页第10页/共39页第11页/共39页第12页/共39页第13页/共39页第14页/共39页第15页/共39页第16页/共39页第17页/共39页第18页/共39页第19页/共39页第20页/共39页在氧化铝柱子上若分离下列各组混合物，哪一个组分先被洗脱下来？和和装柱加样鉴定洗脱收集第21页/共39页三、实 验 内 容实 验 步 骤: 柱色谱操作：干法：10g 硅胶 +乙醇先用乙醇 后用水操作组分颜色组分颜色1mL样品加样操作0.5mL×2乙醇洗涤第22页/共39页三、实 验 内 容装 柱 干法装柱 湿法装柱 吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面，无断层。第23页/共39页装柱时应该注意均匀，不能有气泡，裂缝，否则样品可能顺缝隙流动而不吸附，影响样品的分离，应用质软的物体如吸耳球等轻轻敲击柱身，促使吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面．第24页/共39页三、实 验 内 容加 样 样品为液体，可直接加样；样品为固体，可选择合适溶剂溶解为液体再加样。加样时，要沿管壁慢慢加入至柱顶部，勿使样品搅动吸附剂表面。 第25页/共39页三、实 验 内 容洗 脱 在柱顶不断加入洗脱剂，使洗脱剂永远保持有适当的量，不要让洗脱剂表面流干，使流动相流速适当。第26页/共39页洗脱时应注意：（1）向柱内加入95%乙醇溶液洗脱（可以通过注射器沿管壁或安装滴液漏斗）在恒压或加压条件下进行洗脱。控制流出速度1滴/秒。逐渐出现色层带分离。（2）第一色层带到达色谱柱底部时，立即用锥形瓶收集第一色层的溶液，直到其完全被洗出。【注意】洗脱时切勿使溶剂流干！（3）然后，改用水溶液作为洗脱剂，当第二色层带到达色谱柱底部时，立即收集第二色层的的溶液，直到其完全被洗出。（4）用量筒分别量取所分离出来的两种溶液的体积后，倒入指定的回收瓶中。（5）分离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从活塞 向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。使用过的吸附剂倒入垃圾桶里。第27页/共39页三、实 验 内 容收 集 试样有色，在层析柱上可直接观察。洗脱后分别收集各个组分。 试样无色，收集洗脱液时，多采用等份收集，每份洗脱剂的体积随所用吸附剂的量及试样的分离情况而定。收集的每份洗脱剂的体积越小，分离效果越好。鉴 定 试样无色可结合薄层色谱结果 试样有色依据颜色直接鉴定第28页/共39页三、实 验 内 容第29页/共39页四、注 意 事 项 玻砂防堵塞 装柱需紧密 加压不可大 溶剂勿流干第30页/共39页小 结色谱法在有机化学中的应用:分离混合物精制提纯化合物利用比移值(Rf)鉴定化合物跟踪反应进程第31页/共39页小 结色谱法的特点:分离效率高 复杂混合物,同系物,异构体等。灵敏度高 可以检测出μg? g-1(10-6)级甚至ng? g-1(10-9) 级的物质量。分析速度快 几分钟或几十分钟内可以完成一个试样分析。 第32页/共39页柱色谱法分离甲基橙和甲基蓝第33页/共39页实验原理甲基橙和亚甲基蓝均为指示剂,它们的结构式如下所示:甲基橙亚甲基蓝由于甲基橙和亚甲基蓝的结构不同,极性不同,吸附剂对它们的吸附能力不同,洗脱剂对它们的解析速度也不同,极性小、吸附能力弱、解析速度快的亚甲基蓝先被洗脱下来，而极性大、吸附能力强、解析速度慢的甲基橙后被洗脱下来，从而使两种物质得以分离。本实验以硅胶为吸附剂，95%乙醇作为洗脱剂，先洗出亚甲基蓝，再用蒸馏水作洗脱剂把甲基橙