荧光免疫层析技术的原理与进展.pptxVIP

会计学第1页/共44页 荧光免疫层析技术的基本原理层析法(chromatography)的原理是利用混合物中各组分的物理性质之差(如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)而建立来的一种分离技术。层析系统是由固定相(stationary phase)和流动(Mobile Phase)相组成。第2页/共44页固定相是固体物质或固定于固体物质上的成分。流动相是可以流动的物质，如水或各种溶剂。层析过程：当待分离混合物随流动相通过固定相时，由于混合物各组分的理化性质的差异，与固定相相互作用弱的组分随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移的速度快；与固定相相互作用强的组分向前移动的速度慢。从而实现混合物中各组分的分离。 第3页/共44页 免疫层析法免疫层析技术是建立在层析技术和抗原一抗体特异性免疫反应基础上的一项新兴免疫检测技术。待测物层析方向免疫反应TC第4页/共44页免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛细作用使待测物在层析条上移动。待测物在T线处发生特异性免疫反应。游离物在C线处发生免疫反应。免疫层析技术基本原理示意图第5页/共44页荧光（fluorescence） 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。 发射光谱和激发光谱发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。第6页/共44页荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式: 荧光效率= 荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。 第7页/共44页荧光淬灭定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。引起荧光淬灭的因素：有如紫外线照射、高温、某些硝基化合物、重氮化合物等。待测物层析方向免疫反应TC第8页/共44页免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛细作用使待测物在层析条上移动。待测物在T线处发生特异性免疫反应。游离物在C线处发生免疫反应。免疫层析技术基本原理示意图常用荧光免疫层析法夹心法竞争法双抗原夹心法双抗体夹心法第9页/共44页竞争法第10页/共44页 待测物中的某种抗原与T（检测线）线处同种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过程。结合垫Y1:A的单抗与标记物的偶联体Y2：抗原AY3:羊抗鼠二抗含抗原A免疫层析法检测的实物图第11页/共44页 竞争法结合垫免疫层析法检测的实物图夹心法第12页/共44页待测物中某种抗体（抗原）与T线处抗原A（抗原A）以及荧光标记的抗原（抗体）特异性相结合的过程，在T线处形成抗体A+抗原+抗体B形式的夹心结构。待测液含抗原Ag结合垫(k)Ab1(k)Ab1Ab3-(k)Ab1(k)Ab1-Ag(k)Ab1-Ag-Ab2待测液，不含抗原AgAb3-(k)Ab1阳性结果T,C均有颜色阴性结果T无颜色，C有颜色(k)Ab1Ab2Ab2(k)Ab1TCCT免疫层析法检测的实物图双抗体加心法检测原理图K代表某一标记物第13页/共44页双抗体夹心法第14页/共44页双抗原夹心法双抗原夹心反应模式阳性检测（左）与阴性检测（右）第15页/共44页利用荧光免疫层析试纸条可以实现对待测物的定性或者定量检测.胶体金量子点其他标记物镧系元素碳纳米管有机纳米粒子纳米磁性材料第16页/共44页第17页/共44页胶体金金颗粒之间存在的静电斥力使其在水中保持相对稳定的状态，形成稳定的水溶性胶体，即称为胶体金第18页/共44页胶体金既有明亮的色彩，又有高电子密度，可以吸附生物大分子，且不影响生物分子的活性，故可作为生物分子的标志物，用于免疫反应中抗原或抗体的标记定位，定性甚至定量研究。层析试纸标记用金颗粒的直径大多在 20～ 40 nm，呈深红色。第19页/共44页胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗粒表面的过程。由于蛋白分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态。第20页/共44页胶体金作为标志物有以下优势: ①几乎可标记所有的蛋白分子，过程简单，效率高，用量少，便宜，基本不改变被标记蛋白的活性。且稳定，无毒，使用方便，保质期长。②不同直径的纳米金可以用于多重标记。③结果判断只需普通光学仪器或直接肉眼观察。第21页/共44页胶体金作为标记物的应用第22页/共44页试孕纸第23页/共44页第24页/共44页 应用（定量）08天津大学精密仪器与光电子工程学院与天津市进出口检验检疫局合作开发研发一种便携式仪器。竞争法原理用于农药残留定量检测第25页/共44页