益气活血药对心肌组织及hc细胞cx表达和凋亡的影响.pptxVIP

益气活血药对心肌组织及HC细胞Cx表达和凋亡的影响会计学研究背景第1页/共42页心血管系统疾病是危害人类健康的常见病。心肌缝隙连接蛋白43和细胞凋亡的异常在心血管疾病的发病过程中都扮演了重要角色。 心肌缝隙连接蛋白43心肌细胞凋亡心肌缝隙连接蛋白43(CX43)第2页/共42页缝隙连接是一种特殊膜结构，由两个连接子对接而成，每个连接子包含来自毗邻细胞的六个连接蛋白，直接连接两个细胞的胞质，允许相邻细胞间电信号和化学信号的直接通讯。连接蛋白家族有20多个成员，就心室而言，表达最丰富的是Cx43。Cx43是维持心肌细胞间化学偶联和电偶连的关键结构 第3页/共42页心肌缺血时，Cx43分布和表达异常会导致心肌细胞电偶联的缺失，易于发生室性心律失常甚至猝死 。并且Cx43的异常还会导致心肌细胞间的代谢障碍。 心肌细胞凋亡第4页/共42页细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是一种生理现象，但病理状态下细胞凋亡的增加与心肌缺血、缺血再灌注损伤和心力衰竭的发生都密切相关。 过度的细胞凋亡会加速心肌细胞的丢失，造成心功能的恶化，并促进心室重构的发生和发展。 第5页/共42页材料与方法实验材料第6页/共42页实验动物雄性SD大鼠，体重200～240g，许可号：SCXK（京）2006-0009。 实验细胞Rat H9C2心肌细胞系（ATCC? Number：CRL-1446?） 实验用药生脉注射液（红参、麦冬、五味子），10ml/支，雅安三九药业有限公司（批号：100301）血塞通注射液（三七总皂苷），250mg/10ml/支，昆明制药集团股份有限公司（批号：10DL04）。 主要试剂兔抗Cx43多克隆抗体（批号Hoechst凋亡细胞核和凋亡小体染色试剂盒 （#C1100）实验方法第7页/共42页整体实验分组与给药方法第8页/共42页大鼠随机分为：益气活血组：生脉注射液联合血塞通注射液卡托普利组：卡托普利模型组：生理盐水假手术组：生理盐水连续给药一个月 心肌梗死大鼠模型制备 第9页/共42页参照文献，采用冠脉结扎法制作大鼠心肌梗死模型。——王硕仁,王振涛,赵明镜,李敏.心气虚病证动物模型及其评价体系的构建.中国实验动物学报.2002;10(1): 33-38. 心梗模型大鼠心电图和心脏超声评价第10页/共42页采用心电图和心脏超声评价心梗大鼠造模是否成功。术后与术前比较，大鼠心电图ST段明显抬高。取材前超声检查显示模型大鼠左心室内径明显扩大，室壁变薄，收缩运动减弱，心功能降低。结扎冠脉前 结扎冠脉后模型组 心功能比较在体电刺激诱发室颤实验方法第11页/共42页参照文献，大鼠麻醉后固定，呼吸机辅助呼吸，开胸暴露心脏，连接刺激电极。采用程控电刺激诱发室颤，记录室颤阈值。——柴松波,王硕仁,姚立芳,等.参松养心胶囊对大鼠心梗后心肌重构和和室颤阈值影响的研究.中国中药杂志.2009,34(16):2101-2104细胞实验分组与给药方法第12页/共42页细胞实验以大鼠H9C2心肌细胞系为研究对象，分为两个实验。实验1：生脉联合血塞通注射液对H9C2细胞Cx43损伤的影响实验2：生脉联合血塞通注射液对H9C2细胞凋亡的影响两个实验均分为以下八组正常对照组模型组血塞通低剂量组血塞通高剂量组生脉低剂量组生脉高剂量组生脉和血塞通低剂量组生脉和血塞通高剂量组细胞实验1：诱导H9C2细胞Cx43损伤的方法第13页/共42页参照文献，采用TPA造成Cx43的损伤 。TPA是一种蛋白激酶C的激活剂，可以增加Cx43的磷酸化，从而降低Cx43通道的通透性，还能显著地降低缝隙连接的组装，并使Cx43失去稳定性。——Lampe PD, TenBroek EM, Burt JM, et al. Phosphorylation of connexin43 on serine368 by protein kinase C regulates gap junctional communication[J]. J Cell Biol, 2000, 149(7): 1503-1512.——Lampe PD,Lau AF. The effects of connexin phosphorylation on gap junctional communication[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(7): 1171-1186. 细胞实验1：H9C2细胞Cx43检测方法 第14页/共42页采用免疫细胞化学法检测Cx43的表达主要步骤：用4%多聚甲醛固定细胞15min，血清封闭，滴加1:100稀释一抗4℃孵育过夜。次日加二抗，37℃孵育30min，DAB显色，倒置显微镜拍照观察。 细胞实验2：诱导H9C2细胞凋亡的