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ELISA方法类型及原理会计学第1页/共16页　抗原抗体反应 1.1.1 可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab　 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。第2页/共16页1.1.2　特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。第3页/共16页1.1.3　最适比例 第4页/共16页1.1.4　敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平;酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml;免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相似；标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平;例如，HBsAg，其敏感度可达。第5页/共16页　免疫测定在临床检验中的应用 由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。第6页/共16页2、ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。 第7页/共16页2.1 双抗体夹心法测抗原血清样品或参比品底物酶标抗体加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物；加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，酶量与标本中受检物质的量成正相关；终止液酶标仪测定OD值根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。第8页/共16页 双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。第9页/共16页2. 3 间接法测抗体 加酶标抗抗体：与固相抗原抗体复合物中的 抗体结合，使该抗体问接地标记上酶；将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原；酶标抗体 样本稀释液血清样品或参比品 固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。加受检血清：其特异抗体与抗原结合， 形成固相抗原抗体复合物。终止液底物传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。第10页/共16页例如：猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒【组成】?试剂盒由抗原包被的微孔板，酶标羊抗猪IgG及其它试剂制成，应用间接ELISA原理检测猪血清中抗蓝耳病N蛋白的抗体。【用途】?猪蓝耳病ELISA诊断试剂盒用于检测猪血清中抗蓝耳病N蛋白的抗体。评估猪场蓝耳病疫苗免疫状况。感染猪的血清学诊断。【原理】 试剂盒是采用猪蓝耳病病毒N基因的基因工程表达产物包被检测板。在试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后，若样品中含有猪蓝耳病N蛋白的特异性抗体，则将与检测板上抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入酶标二抗，与检测板上抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物，在孔中加TMB底物液，与酶反应形成蓝色产物，加入HF溶液中止反应后，用酶标仪630nm波长测定各反应孔中的OD值。例如：猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒第11页/共16页【试剂盒主要组成】?1 ?包被抗原的检测板2块? ????（96孔/板） 2 阴、阳性对照血清?? ? 各1管?????（1ml/管）?3 ?抗猪IgG-HRP结合物1瓶????? ?（20ml/瓶）?4 ?20倍浓缩洗涤液1瓶? ?? ?（30ml/瓶）?5 ?底物A液、B液??? ?? 各1瓶 ?? ?（10ml/瓶）?6 ?终止液1瓶???? ?（10ml/瓶）?7? 样品稀释液1瓶??? （50ml/瓶）?8? 血清稀释板2块???? ? （96孔/板）第12页/共16页 竞争法测抗体 血清样品或参比品 酶标抗体 底物 终止液 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，