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会计学1DNA限制性内切酶消化酶切 实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。第1页/共11页 限制性内切酶酶分子识别位点切割位点 限制作用是否需用 ATPⅠ类 三亚基双功能酶 二分非对称至少在识别位点外 1000bpYesⅡ类内切酶与甲基化酶分子不在一起4-6bp, 大多数为回文对称结构 在识别位点中或靠近识别位点无特异性NoⅢ类二亚基双功能酶 5-7 bp 非对称在识别位点下游 24-26bpYes限制性内切酶可分为三类第2页/共11页 Ⅱ类限制性内切酶 Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5…G↓AATTC…3 →5… G AATTC…3 3…CTTAA↑G …5 →3… CTTAA G…5 第3页/共11页 实验材料和试剂实验材料：λDNA：购买或自行提取纯化。 重组pBS质粒或pUC19质粒。实验试剂：EcoR I酶及其酶切缓冲液：购买成品。 Hind Ⅲ酶及其酶切缓冲液：购买成品。琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 第4页/共11页 实验仪器恒温水浴锅第5页/共11页 DNA 1μg反应 10×缓冲液2μL重蒸水19μL1μL酶液+用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3h每管加入2μL 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，电泳检测EP管编号, 加样实验步骤第6页/共11页 对质粒DNA酶切反应 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶, 消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。 第7页/共11页 电泳检测示例第8页/共11页 实验注意事项限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 许多实验制备的DNA不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影响。 第9页/共11页 思考题 如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被酶切或者酶切不完全, 你认为可能是什么原因？ 第10页/共11页