DNA重组酶切和连接.pptxVIP

会计学;;杂带;我们的结果;我们的结果;我们的结果;我们的结果;QA;基因重组－酶切和连接;第9页/共29页;剪切;引物1 5’GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC 3’ CDS 5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT… …………………………………………………………………………. …… ………………………………… AKP CDS …………………………………. ………………………………………………………………………………. ………………………………………………………………………………. CDS ….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’ 引物2 3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5’ ;5’pApCpGoH pApApTpTpCpGpT3’ 3’TpGpCpTpTpApAp oHG pCpAp5’ 5’pApCpGpApApTpTpCpGpT3’ 3’TpGpCpTpTpApApGpCpAp5’ ;; 酶切：370C，水浴酶切3小时(封口膜封口） 酶切产物的纯化和盒回收： 直接进行液体回收： 每100uL溶液加入500uL溶胶液，其余的操作步骤同前。 向柱子的正中央 共加20uL洗脱buffer，其余步骤同前。;; 每100uL溶液加入500uL溶胶液,混匀。 将液体转移至吸附柱，12000rpm离心30秒，去除废液 漂洗:向吸附柱的正中央加入500uL漂洗液，12000rpm离心30秒，去除废液。重复一次。 空柱12000rpm离心2min，以彻底去除废液 将吸附柱置于一新的干净无菌的mLEP管中，向吸附柱的正中央加15uL无菌水，室温放置5分钟。12000rpm离心30秒，以洗脱DNA。 再次向柱子的正中央加5uL无菌水，室温放置5分钟；12000rpm离心2分钟。合并回收液。 SYBR检测回收产物;1%琼脂糖凝胶 25mL (用1xTAE配) 1uL GoldView 样品：酶切DNA 4uL + 0.5uL 10xloading 质粒对照：未酶切质粒DNA 2uL + 0.5uL 10xloading 分子量Marker： 5uL 80伏恒压电泳，结果凝胶成像分析 注意： Marker上5uL时大概的量是50ng/条带 上样精准 上样顺序（对照）;连 接 反 应 体 系（ 20 uL ）;连接产物转化克隆菌株;mol/L的CaCl2 100mL／两组，高压灭菌 2. LB液体培养基 90mL/组，高压灭菌 胰蛋白胨（typtone 酵母提取物（ NaCl 先加90mL水溶解后， 5mol/L NaOH调pH值（18μL）分装：250mL锥形瓶，40mL×2瓶； 15mL大试管, 5mL×2管。;1. 试剂 2. 小指管： 1.5 mL 50个 3. 枪头： 5 mL 8支 4. 50 mL离心管： 4个 5. 直径9cm的平皿： 8套 6. 其它枪头：各1盒;1. X-gal 2. α互补 3. 感受态细胞制备 4. NovaBlue菌株 5. Tuner(DE2)placI菌株;谢谢大家！;;endA：该基因表达非特异性核酸内切酶Ⅰ，它使所有的DNA双链解开。endA基因的突变将使插入的外源DNA更加稳定，提取的质粒纯度更高。 hsdR：该基因表达Ⅰ型限制酶，对外源的各种DNA有严格的限制。hsdR基因的变异导致菌株细胞内的Ⅰ型限制酶活性缺失，这对外源基因的导入及质粒的转化是有利的。;hsdR17(rk12-mk12+)：表示R17 的变异而导致K菌株来源的hsdR的功能丧失。 recA1： recA为基因重组相关的基因，表达ATP依赖型DNA重组酶。该基因突变（recA1）导致同源或异源DNA重组不能进行，保持插入DNA的稳定性，对DNA的转化是有利的。 supE44 (Suppressor) ： 该基因表达的阻遏蛋白与终止密码子UAG结合，使蛋白质合成终止。;Thi-1： 该基因表达与硫氨素合成有关的蛋白和酶，thi 的变异使硫氨素的生物合成不能进行，最小培养基中必须添加硫氨素（VB1），细胞才能正常生长。 gyrA96(Gyra