HBsAg免疫对小鼠TB细胞功能的影响.pptxVIP

会计学1HBsAg免疫对小鼠TB细胞功能的影响 实验流程1W1.双向免疫扩散④2.酶联免疫吸附试验（ELISA) ⑤OVA (1mg/ml)+CFA（500ul）免疫小鼠（腹腔内注射）OVA+CFA （500ul）加强免疫小鼠①无菌取脾和胸腺②摘眼球取血分离血清②2W取脾和胸腺②淋巴细胞转化试验② ③生理盐水（500ul)免疫小鼠（腹腔内注射）生理盐水（500ul）加强免疫小鼠 ①2W 1W对照组实验组 抗体效价增殖功能第1页/共13页 实验内容小鼠摘眼球取血、分离血清淋巴细胞转化试验（一）第2页/共13页 教学要求掌握小鼠血清的分离掌握淋巴细胞转化试验的基本原理及基本操作第3页/共13页 淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test)原理检测方法操作步骤应用第4页/共13页 实验分组及材料器材酒精棉球 若干无菌纱布块 1块/组无菌平皿 1块/组无菌吸头（大、中、小）4盒/room无菌96孔培养板 1块/组可调微量加样器 4套/room细胞计数板 1套/组显微镜 1台/组EP管 若干眼科剪、小镊子 4套/room细胞培养箱（37℃ 5%CO2)酶标仪离心机 2个/room超净台 2个/room动物及试剂小鼠 2只/组(NS,OVA)培养液（IMDM) 无FCS 100ml/room培养液（IMDM)20%FCS 30ml/roomConA（2.5,5,10μg/ml) ml/tube 白细胞计数液（2%冰醋酸）2瓶/roomMTT（二甲亚砜（DMSO) 5ml/组分组： 每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏第5页/共13页 免疫血清分离过程摘眼球取血RT for 2hrsRotation2000rpm for 20minTransfer serum to a new EPDouble diffusionStore at 4℃ELISAml EP第6页/共13页 淋巴细胞转化实验步骤单细胞悬液的制备：小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2)，分别放入预先盛有2ml IMDM培养液的平皿内。将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000μlml EP管中。细胞计数：取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20μl，加到盛有980μl计数液的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。调细胞浓度至1×107/ml，ml，设需要的细胞悬液体积为Aml,可按公式：?/ml×A=1.5×1×107NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。第7页/共13页 细胞计数板查出四个大方格的总细胞数(X)算出每个大方格的细胞数：Y=X/4每个大方格的体积为3=10-4ml制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50)4第8页/共13页 细胞培养：按图所示加样。将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%C02培养箱中，培养48小时。MTT掺入：（隔一天 下午）在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。每孔内加入MTT（5mg/ml) 10μl，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混匀。在37℃ 5%C02培养箱中继续培养2小时，轻轻吸弃上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。加入100μl 二甲亚砜（DMSO)，将颗粒溶解。结果测定：结果测量：用酶标仪测定光密度值A570nm（用空白孔调零），记录结果。结果判定： SI（刺激指数）=Con A刺激孔 A值 / 对照孔A值第9页/共13页 预习内容自讲自评内容： 1.细胞因子检测技术 (理论教材P257–P258) 2.单克隆抗体制备技术 (理论教材P68;实验教材P106-P109)第10页/共13页 课次自讲内容及讲解时间参考教材备注一（10.6）1. 抗体制备技术。（20min）实验教材P100-P103抗体纯化、单克隆抗体制备、基因工程抗体除外。2. 免疫细胞分离及其功能检测。（45min）理论教材P251-P255实验教材P70-P80P255:从NK……以后除外。三（10.15)3. 细胞因子检测技术。（45min）理论教材P257–P258 4. 单克隆抗体制备技术。（30min）理论教材P68实验教材P106-P109四（10.20)5. 抗原抗体反应的特点、影响因素、 分类、原理及应用。(45min)理论教材P238实验教材P110-P112五（10.22)6. 免疫标记技术的分类、原理及应用。（20min）理论教材P244-P251实验教材P13