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骨髓间充质干细胞(MSC)原代培育与传代培育预备工作 (1)试管、试管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、烧杯、橡皮 头、剪刀、银子、纱布、棉球、酒精灯、滴管、移液器、细胞计数器、生理盐水、 PBSs双抗(青链霉素)、75%酒精、95%酒精、培育瓶(50ml, 260ml) o (2) BALB/C小鼠(4?5周龄，18?22g,雌雄不限)、胎牛血清(灭活)、DMEM-LG 培育液(美国GIBCO) (3)针头与注射器：4.5号、7号针头(冲小鼠股骨、胫骨和肱骨骨髓，制单细 胞悬液)。 试验前预备(1)试验室消毒，隔离衣消毒，小鼠固定架消毒。配10%FBS培育液，加双抗 (内含青霉素、链霉素各 (2)用75%酒精擦拭无菌操作台面，取各种已消毒的培育用品置于超净台面， 无菌室及超净台用紫外灯照耀30?60分钟灭菌。 (3)开头工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。穿隔离衣，戴手套。用70%酒 精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10分钟后，才可开头试验操 作。点燃酒精灯，安装吸管帽。 试验步骤 (1) BALB/C纯系小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min后，在无菌操作台上无 菌条件下分别双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨四 周肌肉组织，剪去包括册板在内的两侧防端，用10ml注射器(配4.5号针头) 抽取适量含10%FBS的完全培育基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培育瓶。依次用7号 针头和4.5号针头(或依次过21、23、25号)反复吹打骨髓细胞悬液，制成单 细胞悬液。细胞悬液在lOOOrpm离心5min后收集细胞或进行密度梯度离心。 (2)将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分别液的离心管 中，4七条件下，经500g密度梯度离心25min,当心收集离心液界面上乳白色 云雾状的单核细胞层，加入等量无血清培育基或磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤 (500g离心5min或180g离心1 Omin) 2次,去上清,用10%FBS的培育基悬 浮细胞（用0.83%氯化胺破裂红细胞，培育液重悬细胞）。留意：密度梯度离心 力500g x30min组优于800g x30min。本步骤可以省略。 附：人骨髓：抽取骨髓（或正常人手术肋骨取骨髓3-5ml）,每毫升骨 髓加100u肝素抗凝，充分混匀后，保存于4七冰箱，24小时内分别骨髓MNC。 骨髓先加入等量PBS或Honks液（或培育液）混匀后，以1份淋巴细胞分别液 上面加2份稀释骨髓的比例，将稀释骨髓缓慢加入ficoll液面上（密度1.077）, 水平离心机20℃条件下500g （2000r/min）离心25?30分钟。从界面上取出的 MNC用PBS液洗涤2?3次后，加适量培育液计数。 （3）数细胞数量，达到106?107/ml后即进行原代培育，按5x106/ml浓度接 种于50ml培育瓶中（1X106/cm2培育瓶），每瓶含5ml L-DMEM完全培育液。 在体积分数为5%的CO2和37℃条件下静止培育,3d后换液去除非贴壁细胞， 以后每3?4d半量换液1次，10?12cl细胞达90%融合时传代。 （4）传代培育：传代时先全部吸出培育液后，用无Cci2+、Mg2+PBS液洗涤 二次，加入37次预热的0.25% （2.5g/L, 0.25%）胰蛋白酶（含lmmol/L EDTA, 即用1mmol/L-EDTA-Nci2配制）消化1-2分钟，吸去胰酶，以残留的胰酶连续 消化，倒置显微镜下观看，细胞开头皱缩时（细胞开头变圆）加入完全培育液（3ml 左右）终止胰酶作用。吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管中，1500r/min 离心10分钟后弃上清，再用PBS液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶。 将细胞再悬浮于培育液中，按2?5X105/ml再次接种传代于新的培育瓶中。当 这些细胞生长接近融合层时，即得到骨髓MSCo传至3?5代的MSC按IX 105cells/cm2密度接种于放置有盖玻片的6孔板内，以制备细胞爬片。 注：贴壁细胞的消化，应把握各类型细胞不同的消化时间，避开过度消化，损伤 细胞活力；或消化不足，不能充分解离成单细胞。如为长期试验，每个月重新复 苏一支细胞，避开长期传代引起细胞特性变异。