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基因转染技术及其应用简介会计学第1页/共50页 报告内容一、基因转染简介二、基因转染的基本方法三、基因转染技术的应用第2页/共50页一、基因转染简介1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。第3页/共50页二、基因转染的基本方法(一)重组子构建(二)基因转染真核细胞的基本方法第4页/共50页(一)重组子构建1.目的基因的制备和获取2. 哺乳动物细胞表达载体的选择3. DNA片断的重组连接4. DNA重组体的鉴定第5页/共50页1.目的基因的制备和获取(1)目的基因 是所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段(2)目的基因常用的制备方法 第6页/共50页A.限制酶切除 a.从原核基因组DNA制备－视原核基因组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。 b. 从真核基因组DNA制备 c.从已克隆的DNA片段制备第7页/共50页B. PCR或RT/PCR方法制备目的基因a. 获取已知基因 据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知） → 设计/合成一对引物 → PCR（基因组DNA为模板）/RT-PCR(mRNA为模板) → 从组织或细胞制备目的基因b. 构建RT/PCR文库法获取未知基因 据mRNA末端如polyA尾设计共同引物 → 将所用mRNA并逆转录成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾 → 采用一对共用引物扩增所有cDNA，插入适当载体→ 构成PCR－cDNA文库筛选第8页/共50页C.计算机克隆－即利用GenBank信息，利用不同种属同源性设计引物，尝试获取未知基因片段，这有赖于各种计算机软件的应用。D.化学合成法制备基因片段－用DNA合成仪，对目的基因分段合成，连接，可以得到所需的目的基因。第9页/共50页2.哺乳动物细胞表达载体的选择哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒型载体（1）质粒型载体 哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质粒而获得的，主要是在质粒的基础上插入了一些病毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。A. 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件: a.启动子 b.增强子 c. 多聚腺苷酸化信号 d. 药物选择标记基e. 报告基因 f.表位标签第10页/共50页B.常用的哺乳动物表达质粒载体b. pSIc. pCMV-HAe. pTRE第11页/共50页（2）病毒型载体 病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因，这类载体将来在基因治疗中将具有非常重要的价值。目前应用的病毒类型包括：逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒和杆状病毒等。 A．逆转录病毒载体 逆转录病毒的优点是，可以使外源基因整合到基因组中，因而可以被稳定传代和表达。但是，由于逆转录病毒的插入位点是随机的，因而在基因组内的整合有可能破坏一些内源基因的结构，尤其是当插人到一些重要的基因位点时会导致细胞的异常。第12页/共50页B.腺病毒载体 易于培养、纯化，在感染过程中复制与转录依赖于宿主细胞的聚合酶，可插入较大的外源基因片段，且腺病毒基因不会发生整合，是研究真核基因的良好模型。3.DNA片断的重组连接第13页/共50页粘端连接方法要点平端连接方法要点①单酶单切点 防自身环化，希望定向插入；②双酶双切点 定向克隆，构建表达载体的最好用此法；③利用同裂解酶产生相同粘端。①平端，平端连接；②Linker连接酶切产生粘端连接；③Adaptor衔接目的基因和载体；④同源同聚尾，克隆cDNA的最好方法⑤T载体，PCR产物T/A克隆法连接。第14页/共50页4. DNA重组体的鉴定 外源DNA片断是否插入载体构成重组DNA分子，而插入片断大小，是否突变及插入位置，顺序及方向则关系到构建载体是否扩增，我们所需要的基因或表达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴定DNA重组体（1） 酶切鉴定是必需的，基于下述: A. 限制性图谱个体特异性，不同的载体或DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样，电泳图谱不一样。 B. 同一载体连接不同的DNA片断，不同的载体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是不同的 。 C. 插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位点)酶切，一般来说用3种限制酶切： ①可鉴定载体及 ②插入片段的大小,方向,切后并电泳分析,以确定是否得到预期的rDNA。第15页/共50页（2）若构建DNA重组体是为了克隆某个基因，可进行在序列测定。（3）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。第16页/共50页(二)基因转染真核细胞的基本方法 对外源基因转染方法的要求包括：转移效率高，不影响细胞的正常生理活动，低毒性，容易使用，重复性好，易获得稳定转化子。根据转染的机制不同可将转染法分为： 1.化学转染