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会计学1基因工程的操作程序new 1.2基因工程的基本操作程序侍 燕第1页/共26页 基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞操作过程目的基因的检测与鉴定第2页/共26页 目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因目的基因的获取供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来　目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。第3页/共26页 获得目的基因的方法 1）从基因文库中获取目的基因1.什么是基因文库？2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？2）2）利用PCR技术扩增目的基因3）人工合成 种类：基因组文库：cDNA文库：含有一种生物的全部基因含有一种生物的部分基因根据基因的有关信息：如基因的转录产物mRNA第4页/共26页 1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。—— 核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(二)基因表达载体的构建第5页/共26页 基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA 连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。第6页/共26页 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 资 料:第7页/共26页 基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因第8页/共26页 (三)将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化——目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达第9页/共26页 方法导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法—— 感受态细胞吸收DNA分子(三)将目的基因导入受体细胞第10页/共26页 (四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定—①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交DNA分子杂交抗原-抗体杂交第11页/共26页 PCR技术—聚合酶链式反应原理：前提：条件：PCR扩增仪DNA双链复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的两条链为模板温度控制第12页/共26页 类别项目?复制?转录场所特点模板原料酶能量碱基配对产物细胞核只有DNA的一条链四种核糖核苷酸RNA聚合酶ATPA-U C-G T-A G-C细胞核DNA的两条链四种脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶ATPA-T C-G T-A G-C两个双链DNA分子一条单链mRNA边解旋边复制，半保留复制边解旋边转录第13页/共26页 5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G变性复性延伸1.目的基因DNA受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ第14页/共26页 利用PCR技术扩增目的基因第15页/共26页 PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成_______ b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。 氢键单链DNA双链D