研究生基因分子生物学课程.pptx

1（一〕DNA聚合酶最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有：大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕大肠杆菌DNA聚合酶 I大片段（Klenow片段〕T4和T7噬菌体DNA聚合酶（来源于T4和T7噬菌体感染的大肠 杆菌〕经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶〕热稳定D NA 依赖性 DNA聚合酶反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶〕末端脱氧核苷酸转移酶第1页/共80页第一页，共81页。 2Substrates required for DNA synthesis第2页/共80页第二页，共81页。 3Diagram of the mechanism of DNA synthesis第3页/共80页第三页，共81页。 4Illustration of the path of the template DNA through the DNApolymerase第4页/共80页第四页，共81页。 5Base tautomers第5页/共80页第五页，共81页。 6Proofreading exonucleasesremoves bases from the3’ end of mismatched DNA第6页/共80页第六页，共81页。 7外切核酸酶的校对工作方式就像电脑键盘上的“delete key”,只纠正最近的一个错误。这种校对功能极大地增加了DNA合成的准确性。DNA聚合酶掺入错误碱基的几率≈1/105外切核酸酶的校对功能降低了掺入错误碱基的几率≈1/107事实上一个细胞中发生突变的几率≈1/1010第7页/共80页第七页，共81页。 81大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕：由单一多肽链组成（Mr约103 000），由大肠杆菌polA基因编码，可通过三个明确的功能域执行三种酶反应。结构域活性生化功能羧基端结构域（543～928位，约46kDa)5’→3’DNA聚合酶将dNTP的单核苷酸残基加到RNA或DNA引物的3’羟基端。这些末端由双链DNA中的切口或裂缝以及与单链DNA分子碱基配对的RNA或DNA短片断组成。中间结构域（336～542位，约22kDa)3’→5’外切核酸酶切割3’羟基端的核苷酸残基，产生3’凹端氨基端结构域（1～325位）5’→3’外切核酸酶碱基配对的5’端寡核苷酸的切割第8页/共80页第八页，共81页。 9具有3种活性：5’→３’ DNA聚合酶活性5’→３’ 及３’→５’ 外切核酸酶活性主要用途－用切口平移方法标记DNA，在所有聚合酶中 只有大肠杆菌DNA聚合酶 I能用于此反应，因为它具有 5’→３’外切核酸酶活性，可以在聚合酶沿DNA链推进之 前，从DNA链上去除核苷酸。 还可用于cDNA第二链的置换合成及对带有3’突出尾的 DNA分子进行末端标记。第9页/共80页第九页，共81页。 10 5’ 3’ 3’ 5’ Mg2+ DNase I 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ dATP dCTP 大肠杆菌DNA聚合酶I dGTP (全酶〕 dTTP 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’