医学课件-基因工程及其医学应用.pptxVIP

基因工程及其医学应用 Genetic Rebination and Genetic Engineering第1页，共89页。概论第2页，共89页。基因片段质粒DNA重组DNA基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。第3页，共89页。重组DNA技术发展史第4页，共89页。pR6-5pSC101EcoRI大肠杆菌Boyer 和Cohen的实验Boyer 和Cohen的实验第5页，共89页。pSC101pR6-5抗四环素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素基因DNA连接酶重组DNA分子第6页，共89页。大肠杆菌培养平皿四环素\卡那霉素基因四环素平板卡那霉素基因第7页，共89页。第一节 基因工程概念第8页，共89页。（一）DNA克隆克隆 来自同一始祖的相同拷贝的集合。分子克隆细胞克隆动物克隆第9页，共89页。DNA克隆 应用酶学方法，在体外将某些遗传物质的DNA与载体DNA结合，形成一种具有自我复制能力的DNA分子，转化至宿主细胞中，进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。第10页，共89页。目的基因扩增宿主细胞复制子扩增载体提取DNA分子DNA克隆第11页，共89页。（二）基因工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。目的① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）第12页，共89页。分 SS基因基因载体切接转重组体筛SS表第13页，共89页。目的基因某功能蛋白宿主细胞重组体基因工程产品 按照人的愿望设计和建造非天然的基因表达体系。第14页，共89页。第 二 节自然界的基因重组DNA Rebination第15页，共89页。一、接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。第16页，共89页。质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子可接合质粒如 F 因子(F factor) 第17页，共89页。二、转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。 第18页，共89页。例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。第19页，共89页。第20页，共89页。三、转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。第21页，共89页。例溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径(lysogenic pathway)λ噬菌体的生活史目 录第22页，共89页。目 录第23页，共89页。四、基因重组（一）同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous rebination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 第24页，共89页。（二）位点特异重组位点特异重组(site-specific rebination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。第25页，共89页。例 λ噬菌体DNA的整合λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 第26页，共89页。（三）转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。第27页，共89页。第 三 节 基因工程的核心技术第28页，共89页。一、重要的技术工具 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶第29页，共89页。重组DNA技术中常用的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶