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流式细胞术原理和应用;一 简介
二 构造及工作原理
三 FCM的数据分析
FCM的应用
实例;一 简 介;流式细胞仪的特点;举例:细胞周期分布检测
;流路 (液流系统)
流动室
鞘液SHEATH
样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
光路(光学系统)
光源
滤片
电路(检测系统)
光电倍增管PMT
放大电路HV及GAIN 增益
A/D转换
统计 (分析系统)
计算机; 流动室是仪器核心部件,被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成,并在石英玻璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔,供细胞单个流过,检测区在该孔的中心,这种流动室的光学特性良好,流速较慢,因而细胞受照时间长,可收集的细胞信号光通量大,配上广角收集透镜,可获得很高的检测灵敏度和测量精度。;流动室; 激光光源:目前台式机FCM,大多采用氩离子气体激光器。激光(laser)是—种相干光源,它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照,是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动,每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右,每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱,与被照射的时间和激发光的强度有关,因此细胞需要足够的光照强度。 ;信 号;散射光信号 —— 细胞大小及颗粒性;;流式细胞仪光路图;电路 电压调节;电信号输入到放大器放大,放大器分两类:线性放大和对数放大。
细胞DNA含量、RNA含量等的测量一般选用线性放大测量。
在细胞膜表面抗原等的检测时,细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍,甚至几万倍,通常使用对数放大器。 ;常用荧光染料介绍;光路补偿FITC/PE/ECD/PC5;三 FCM的数据分析;2. 双参数二维点图;3. 等高线图 4. 密度图;白血病免疫分型
HLA-B27: 强直性脊柱炎
淋巴细胞亚群
造血干细胞计数:造血干细胞移植
网织红细胞
PNH诊断(CD55、CD59)
血小板活化试验;细胞大小
细胞的颗粒度
细胞表面分子:CD 系列
细胞浆内分子:胞内细胞因子
细胞核内分子:P53
细胞功能检测:细胞周期、凋亡
; 荧光信号的定量可以用 平均荧光强度(mean值),荧光信号面积(Area,A)来表示。;2)DNA Analysis;;;3) Apoptosis 检??;A) DNA片断化检测;B) Caspase-3活性的检测 ;C) Annexin V Assay;Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡;D) TUNEL ;五 实例;细胞周期检测;;A;蛋白表达的检测;凋亡检测(Annexin V/PI双染);Thank you!
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