选修三基因工程基本操作程序讲课用.pptxVIP

一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是______________________编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成请阅读P8、9第一和二两段第1页/共41页第一页，共42页。 一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取1.基因文库：概念见P92.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类种类基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库3.基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。4.获取目的基因的根据：见课本P9第2页/共41页第二页，共42页。 5.基因文库的构建方法之一（1）直接分离法(鸟枪法)提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许 多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库第3页/共41页第三页，共42页。 反转录法：cDNA的合成流程图解5.基因文库的构建方法之mRNA与载体连接导入受体菌群逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA(cDNA)该生物cDNA文库第4页/共41页第四页，共42页。 基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较第5页/共41页第五页，共42页。 1、 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。聚合酶链式反应体外特定DNA片段2、原理：DNA复制二、利用PCR技术扩增目的基因第6页/共41页第六页，共42页。 四种脱氧核苷酸(dNTP) 一对引物：热稳定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA( 需含有目的基因 ) Mg2+(激活剂)3.条件：缓冲溶液一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物4.前提：第7页/共41页第七页，共42页。 5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G变性复性延伸1.变性(90---95度)：目的基因DNA受热变性，解链为单链；2.复性（55---60）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；3.延伸（70---75）：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，从5′端→3′端进行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ5、扩增过程第8页/共41页第八页，共42页。 2、具体过程第9页/共41页第九页，共42页。 PCR(多聚酶链式反应) 第10页/共41页第十页，共42页。 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 ③条件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.等②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）第11页/共41页第十一页，共42页。 ⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。 氢键单链DNA双链DNA链第12页/共41页第十二页，共42页。 PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子第13页/共41页第十三页，共42页。 目的基因的mRNA单链DNA (cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：3、人工合成的目的基因第14页/共41页第十四页，共42页。 1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口