DNS比色法测定还原糖和总糖.docxVIP

还原糖和总糖的测定 (3,5-二硝基水杨酸比色法) 一、实验目的 1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理 2、学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。 还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类。单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，例如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用各种糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。对非还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成还原性单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(常以葡萄糖含量计)。 还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物，而氧化剂 3,5-二硝基 水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以系数 0.9。 三、实验材料和试剂 1、实验材料 面粉 2、实验试剂 ① 1mg/ml 葡萄糖标准液 准确称取 80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到 100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100ml，混匀，4℃ 冰箱中保存备用。 ② 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂 将 6.3g DNS 和 262ml 2M NaOH 溶液，加到 500ml 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至 1000ml，贮于棕色瓶中备用。 ③ 碘-碘化钾溶液：称取 5g 碘和 10g 碘化钾，溶于 100ml 蒸馏水中。 ④ 酚酞指示剂：称取 0.1g 酚酞，溶于 250ml 70%乙醇中。 ⑤ 6M HCl 和 6M NaOH 各 100ml。 四、实验器材 具塞玻璃刻度试管：20ml×11 大离心管：50ml×2 烧杯：100ml×1 三角瓶：100ml×1 容量瓶：100ml×3 刻度吸管：1ml×1；2ml×2；10ml×1 恒温水浴锅 沸水浴 离心机 扭力天平 分光光度计 五、操作步骤 1、制作葡萄糖标准曲线 取 7 支具塞刻度试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1mg/ml 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 DNS 试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。 表 1 葡萄糖标准曲线制作 管 号 1mg/ml 葡萄糖 标准液(ml) 蒸馏水 DNS 葡萄糖含量 (ml) (ml) (mg) 光密度值 (OD-540nm) 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5min 取出，冷却至室温，用蒸馏水补足 至 10ml，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540nm，用 0 号管调零点，分别测出 1~6 号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg) 为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 2、样品中还原糖和总糖的测定 ① 还原糖的提取 准确称取 3.00g 食用面粉，放入 100ml 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后补足至 50ml 蒸馏水，搅匀，置 50℃恒温水浴中保温 20min，使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到 50ml 离心管中，于 4,000r/min 离心 5min， 沉淀可用 20ml 蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液收集在 100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。 ② 总糖的水解和提取 准确称取 1.00g 食用面粉，放入 100ml 三角瓶中，加 15ml 蒸馏水及 10ml 6M HCl，置沸水浴中加热水解 30min(用碘-碘化钾溶液检查水解是否完全)。待三角瓶中的水解液冷却后，加入 1 滴酚酞指示剂，用 6M/l NaOH 中和至微红色(至中性)，用蒸馏水定容在 100ml 容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液 10ml，移入另一 100ml 容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。 ③ 显色和比色 取 4 支具塞刻度试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，空 白调零可使用制作标准曲线的 0 号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。 管 还原糖待号 测液 表 2 样品还原糖测定 （mL）70.51.51.580.51.51.59111.5101 （mL） 7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 9 1