微生物的分离和纯化.pdfVIP

实验十四 微生物的分离和纯化 一、目的要求 掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术。 二、基本原理 在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一 起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有 这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不 同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长 的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板 划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的， 因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌 株。 三、器材 高氏1 号琼脂培养基，肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml 无菌水的试 管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10％酚， 无菌培养皿，链霉素，土样等。 四、操作步骤 1．稀释涂布平板法 （1）倒平板将肉膏蛋白胨培养基、高氏1 号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待 冷至55—60℃时，向高氏1 号琼脂培养基中加入10％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉 素溶液，使每毫升培养基中含链霉素30μg。然后分别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法 是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手 掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或 瓶塞不必夹在手指中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一 缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上， 待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开 培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板，如图Ⅶ-1 所示。最好是将平板放室温2—3 天， 或 37℃培养24 小时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。 （2）制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中， 振摇约20 分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤 悬液注入盛有9ml 无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml 无菌吸管从 -1 -2 -3 -4 此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10 、10 、10 、10 、 -5 -6 10 、10 各种稀释度的土壤溶液。 -4 -5 -6 （3）涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10 、10 和10 三种 -4 -5 -6 稀释度，然后用三支1ml无菌吸管分别由10 、10 和10 三管土壤稀释液中各吸取0．2ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，如图Ⅶ-2 所示。 （4）培养 将高氏1号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3—5 日， 肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2—3 日。 （5）挑菌 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置 28℃和37℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查 是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。 整个分离过程见图Ⅶ-3。 2．稀释混合平板法 -4 此法与稀释涂布平板法基本相同，无菌操作也一样，所不同的是先分别吸取0．5ml10 、 -5 -6 10 、10 稀释度的土壤悬液对号放入平皿，然后再倒入溶化后冷却