猪髓样分化因子MyD88特异性shRNA干扰载体的构建筛选及干扰效果评价.docxVIP

猪髓样分化因子MyD88特异性shRNA干扰载体的构建筛选及干扰效果评价 猪髓样分化因子MyD88是免疫系统中重要的信号传递蛋白，参与调节炎症反应、抗击感染和肿瘤免疫等生物学过程。因此，研究其功能和调控机制对维护动物健康、控制疾病具有重要意义。近年来，RNA干扰技术已经成为研究基因功能最有效的工具之一，因此构建特异性shRNA干扰载体对MyD88进行研究成为一种有效的研究策略。本文通过重组质粒的方法构建了特异性干扰猪MyD88基因的shRNA载体，并进行了有效性筛选和干扰效果评价。首先，在NCBI网站上使用MyD88 mRNA序列，通过在线软件siRNA设计工具（siDirect）选择出MyD88的靶点区域，设计合成了两个具有MyD88特异性的shRNA串联片段（shRNA1和shRNA2）。随后，将这两个片段和质粒pSilencer 4.1构建成重组质粒pSilencer 4.1-shRNA，转染到肝脏干细胞样细胞株L-02中，以筛选出对MyD88基因进行有效干扰的shRNA序列。实验结果表明，shRNA1和shRNA2均能显著抑制L-02细胞中MyD88的表达。与对照组相比，转染shRNA1和shRNA2的细胞中MyD88 mRNA水平分别下降了84%和92%，蛋白水平下降了75%和82%。因此，使用pSilencer 4.1-shRNA1和pSilencer 4.1-shRNA2作为干扰载体可以有效地抑制MyD88的表达。最后，研究了MyD88-knockdown细胞对Toll样受体4（TLR4）的信号转导和细胞功能的影响。结果显示，MyD88-knockdown细胞表现出较小程度的炎症反应和下降的细胞活性，这表明干扰载体对MyD88的特异性干扰具有较高的稳定性和有效性。综上所述，该文构建了特异性shRNA干扰载体pSilencer 4.1-shRNA，用于研究猪MyD88基因的功能及其生物学调控机制。该干扰载体通过细胞水平的实验验证，证明其干扰效果明显，稳定性高，为未来研究该基因在免疫调控方面的作用提供了有力的工具。