RNApull down试剂盒 20164说明书.docx

Pierce? Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit 说明书 20164 thormo scientific （英语水平有限 不对之处敬请指正 by 朵朵） 其他材料要求 ?目标标记RNA ?加热混合器或冷水机组 ?氯仿:异戊醇(24:1) ?无水乙醇, ?细胞裂解液(用于制备细胞裂解产物)（IP 级蛋白提取液） ?交替洗脱缓冲:SDS 上样缓冲(可选) Tris-buffered 含有 0.05%tween?-20 洗涤剂(TBS-T) ?磁力架 ?免疫印迹试剂 ?硝酸纤维素膜(产品)或 PVDF(产品号 88585) SuperSignal?发光液(产品号 34080)做 WB 发光用的超敏发光液?电泳仪器 转膜仪器注意：在无RNA 酶的条件下 操作，戴手套，口罩，清洁台面，使用无酶的反应器。?山羊Anti-Mouse 免疫球蛋白 g(H + L),合共轭(产品号 31430) 辣根标记的二抗羊抗鼠 SuperSignal?发光液(产品号 34080)做 WB 发光用的超敏发光液 ?电泳仪器 转膜仪器 注意：在无RNA 酶的条件下 操作，戴手套，口罩，清洁台面，使用无酶的反应 器。 A 磁珠的预处理 1。轻柔地摇动使磁珠重悬。 2。吸取一定量的磁珠至一个无酶 EP 管。 3。放置于磁力架上将磁珠收集在一起。 4。2 x 体积的 0.1 m 氢氧化钠洗两次磁珠,50 mm 氯化钠(nuclease-free)。5。生理盐水在 100mM 洗磁珠一次。 6。继续用磁力架平衡磁珠捕获。B 细胞的裂解 ?细胞裂可使用标准的细胞裂解液。(e.g., Thermo Scientific Pierce IP Lysis Buffer, M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent and T-PER Tissue Protein Extraction Reagent). ?体外翻译的蛋白（可以用人类体外表达工具）(e.g., Thermo Scientific 1-Step Human IVT Kits, Product No. 88881-9)也可用来检测该蛋白质绑定 RNA 的的能力。 ?确保细胞裂解后蛋白浓度大于 2 毫克/毫升,其中不能含有高盐或洗涤剂，否则会干扰绑定反应, C 标记目的 RNA 用 20163 标记目标 RNA。 注意：最后加入 PEG30%并充分混合，放于合适的温度，合适的时间。为了pull-down 反应，用等体积的氯仿：异戊醇 24:1,提取标记的 RNA ，并使用无水乙醇沉淀 RNA。 D 绑定标记 RNA 链霉亲和素的磁珠 注意：使用 25-100pmol RNA 比 20-50ul 的磁珠。如下说明用的是 50pmolRNA 和50ul 磁珠。 注意：阳性和阴性 RNA 对照都在试剂盒中。用于检测用户提供的 RNA 的特异性，需要检测阳性、阴性和只含裂解液的对照 1、加入 50ul 磁珠到 1.5mlEP 管中。 2、放置于磁力架并使其沉于底部。弃上清。 用等体积的 20mM Tris （PH7.5）,用移液器或者漩涡器重悬磁珠。 重复步骤 2-3 重复步骤 2 加入等体积的 1XRNA Capture Buffer. 用移液器或者漩涡器 重悬磁珠。 加入 50pmol 标记的 RNA 到磁珠，用移液器轻柔地混合 在室温下搅拌孵育 15 - 30 分钟 E RNA-蛋白绑定 注意：Protein-RNA 绑定缓冲液是作为绑定反应的起点，额外的试剂也可以被添加到绑定缓冲液用以提高亲和力和特异性。User-developed binding buffers 也兼容这个试剂盒。 1、置于磁力架，收集磁珠，弃上清。 2、用等体积的 20mM Tris （PH7.5）,用移液器或者漩涡器重悬磁珠。 重复步骤 1-2 重复 1. 稀释 10X 蛋白-RNA 绑定 buffer 至 1X 加入 100ul1X 的蛋白RNA 绑定 buffer 到磁珠中并混合均匀。 准备一个 RNA-蛋白绑定体系 置于磁力架，收集磁珠，弃上清。 加入 100ul 步骤 7 制备的混合液到RNA 绑定的磁珠中，混合均匀。 孵育 30-60 分钟，4℃搅拌或者旋转。f .洗涤和洗脱的 rna 结合蛋白复合物 置于磁力架，收集磁珠，收集上清 加入等体积的 1Xwash buffer （100ul） 重复两次步骤 1 和 2，收集上清进行分析。 重复 1 步骤。 加入 50ulElution Buffer 到磁珠并涡旋混合。37 摄氏度 孵育 15-30 分钟。 置于磁力架，收集磁珠 收集上清进行分析 如果下游需要继续做 wb，加入上样 BUFFER 9.100 摄氏