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实验四 生物标志物实验——水生动物谷胱甘肽转移酶活性测定 指导老师：刘汝涛目录1 目的与要求2 实验原理3 设备与材料4 步骤与方法5 结果与报告1目的与要求〔1〕了解有机污染物对代谢关键酶谷胱甘肽转移酶活 性影响。〔2〕掌握谷胱甘肽转移酶酶活性的体外测定方法。2实验原理 谷胱甘肽转移酶〔GSTs；也叫谷胱甘肽转硫酶〕是细胞质内催化相Ⅱ反响起解毒作用的重要酶，具有许多同工酶。污染物进入体内经过相Ⅰ反响后，在谷胱甘肽转移酶的催化下，细胞内复原性谷胱甘肽能结合相Ⅰ反响产生的亲电性中间体，从而生成亲水性的化合物。细胞膜上有多种的跨膜运输机制〔如通过ATP推动GS-X泵〕能使这类亲水性的化合物排出细胞，使之进入血液循环并最终以尿液等形式排出体外，从而起到解毒作用。在很多物种中，谷胱甘肽结合作用是相Ⅱ反响的主要形式。 GSTs催化的一般反响为： GSH +R-X = GSR + HX 在该反响中，GSTs的主要功能是通过其活性中心增加GSH和亲电性底物的接触时机，然后激活GSH上琉基，诱导其对底物的发动亲核性攻击从而形成结合产物。2实验原理 迄今的研究说明GSTs存在于所有的动物体内，肝脏是脊椎动物种GSTs分布的主要场所。鼠肝中的GSTs占可溶性肝蛋白的10％，而鱼肝中的GSTs也是可溶性肝蛋白的主要成分。GSTs能被多种的污染物所诱导，如有机氯农药、多环芳烃和多氯联苯等。在哺乳动物中，经多环芳烃处理后，其肝脏中GSTs活性比对照组高1.5～2.0倍。在不同的水生动物体内GSTs可被多环芳烃诱导，其活性高于对照组2倍。野外研究发现，在同一条河流中，污染段面鱼体内肝脏组织和消化管组织中GSTs含量和活性比清洁断面高出3～4倍。然而，研究也发现GSTs活性活性诱导受环境条件、生物种类和化合物性质的影响，存在较大的差异。 基于上述原因，用GSTs作为生物标志物来指示特定的污染暴露，近年来在生态毒理学的研究中获得了广泛的运用。在本实验中，将采用体内实验的方法，测定水生动物暴露于有机氯农药林丹〔Lindane〕之后，其体内GSTs酶活性的变化。3设备与材料 1．器材 冷冻离心机〔Beckman Coulter 22R centrifuge〕，酶标仪〔Bio-Tek Instruments，INC〕pH计，溶解氧测定仪，电导率测定仪，96孔板，1.5mL离心管，水浴锅，生物冰袋，移液枪〔20uL、100uL、1000uL〕及对应枪头。 2．受试生物 成年雄性的钩虾〔Gammarus pulex〕。从野外采集投放在 10L的有机玻璃缸中，人工曝气，在 15℃〔±1℃〕，12h光照的条件下至少驯养一周，才能进行染毒暴露。驯养期间，用接种了真菌〔Cladospurium sp.〕发酵1周的桤木叶〔Alnus glutinosa L.〕喂食。3设备与材料 3．试剂 1-氯-2，4-二硝基苯〔CDNP〕，复原性谷胱甘肽〔GSH〕，谷胱甘肽转移酶标准品〔GSTs〕，苯甲基磺酰氟〔PMSF〕，Triton X-100〔聚乙二醇辛基苯基醚〕，EDTA。 4．溶液的配制 〔1〕林丹储存液 取50mg林丹固体颗粒，溶于500mL的丙酮中配制成100mg/L的林丹储存液，于4℃下阴暗处密封保存备用。3设备与材料 〔2〕酶和缓冲液 ①配置pH=6.5，0.02M磷酸缓冲液〔PB〕 利用此磷酸缓冲液配制下面三种实验缓冲液： 〔i〕组织破碎缓冲液〔HB〕：含有1.0％Triton X-100〔v/v〕和1.0％PMSF〔v/v〕的磷酸缓冲液； 〔ii〕冲洗缓冲液〔DB〕：含有1.0％PMSF〔v/v〕的磷酸缓冲液； 〔iii〕空白缓冲液〔BB〕：含有0.1％Triton X-100〔v/v〕和1.0％PMSF〔v/v〕的磷酸缓冲液。 ②100mmol/L PMSF溶液 用95％乙醇溶解适量的PMSF，于阴暗处保存，-20℃可保存一个月，-4℃可保存5d。3设备与材料 ③40mmol/L CDNB溶液 用95％乙醇溶解适量的CDNB，保存方法与PMSF相同。 ④20mmol/L GSH标准液的配制 配制100mmol/L EDTA母液，用0.1mol/L KH2PO4稀释母液至EDTA的浓度为1mmol/L。在1mmol/L的EDTA溶液中加人适量GSH使其终浓度为20mmol/L。用1mol/L HCl或1mol/L KOH校正pH。于阴暗处保存，-20℃可保存一个月，-4℃可保存5d。 ⑤酶活测定液 实验之前配制，将CDNB和GSH溶液从冰箱中取出，置于室温。取5份的20mmol/L GSH标准液、9份的磷酸缓冲液〔pH=6.5，0.02mol/L〕和1份的40 mmol/L CDNB溶液，充分混合，配制成酶活测定液。4步骤与方法 1．暴露试验 按照急性毒