第四章转入及筛选.pptVIP

转位/座（transposition） 转位是一组基因从一处转位到基因组的另一个位置，免疫球蛋白的生产就是通过基因转位和重组而生产的过程。 第30页，共65页。 重组子的筛选和鉴定 第31页，共65页。 （一）根据载体的性状变化进行筛选 1 根据载体的抗药性标记进行筛选 第32页，共65页。 载体上的抗药基因： 抗氨苄青霉素基因 抗四环素基因 抗卡那霉素基因等 凡是转入了载体的细胞都获得了这种 抗药性，可以在平板上生长菌落。 第33页，共65页。   当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不能生长。只带有一种抗药基因的载体组成的重组DNA，在琼脂平板上生长成菌落是不能被区分是否是真正含有重组DNA的抑或是空载体，需要进一步的鉴定。 第34页，共65页。 第35页，共65页。 2 根据载体抗药性插入失活选择 第36页，共65页。 根据载体抗药性标志插入失活选择  含有两个以上的抗药基因的载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。 第37页，共65页。 第38页，共65页。 第39页，共65页。 第40页，共65页。 外源基因 抗Amp 抗Tet 抗Amp 抗Amp 抗Tet 抗Tet 重组DNA 空载体 不含有载体或重组DNA 第41页，共65页。 3 ?-半乳糖苷酶系统 第42页，共65页。 β-半乳糖苷酶系统  载体：pUC、pGEM系列载体等 带有一个来自大肠杆菌DNA的短序列，其中含有编码β-半乳糖苷酶（β- galatosidase）基因（LacZ基因）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，不影响功能。 第43页，共65页。 α-互补的原理 所谓基因内互补作用，在LacZ体系中,是指二个彼此互补的突变基因（突变体1只含LacI和LacZ的N端145个氨基酸的α肽；突变体2缺乏LacZ的N端α肽），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β-半乳糖苷酶活性, 进而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ α肽区段的多克隆位点后, 就会阻断α序列的读码结构, 使其编码的α肽失去活性, 使重组子所在的细菌不能完成α-互补, 因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。此法又称蓝白筛选法。如图5-1 第44页，共65页。 当这种载体转入的宿主细胞是含有β-半乳糖苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列可以互补（成为α互补），产生具有酶活性的蛋白质（β-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有IPTG,X-gal的培养基上呈蓝色。  当多克隆位点有外源DNA片段插入时，破坏此酶的N端阅读框架，产生无α互补功能的N端片段，因此在带有外源DNA片段的细菌在含有IPTG/X-gal的培养基上呈白色。? 第45页，共65页。 LacZ基因 ?-半乳糖苷酶 在X/gal培养基上呈现兰色 X-gal X(发色底物)+gal(半乳糖) ?-半乳糖苷酶 第46页，共65页。 第四章转入及筛选 第1页，共65页。 重组DNA分子转入宿主细胞 第2页，共65页。 重组DNA分子转入宿主细胞的方式 转化（transformation） 转导（transduction） 转染（transfection） 接合转移（conjugation） 第3页，共65页。 转化（transformation） 将重组DNA分子引入细菌（原核细胞），使其在细菌体内扩增及表达的过程。 第4页，共65页。 宿主细胞  原核细胞：大肠杆菌 真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞  第5页，共65页。 重组体分子导入原核细胞 感受态细菌：细菌表面正电荷增加，细胞壁和膜的通透性增加，利于DNA分子的吸附和吸收 第6页，共65页。 （1）CaCl2转化： [原理]： 当细菌处于0℃、二价阳离子（如C