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第二章 基因工程常用的工具酶第一节 限制性核酸内切酶第1页，共34页。 限制性核酸内切酶：简称限制酶。是一类能识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶 20世纪50年代发现： λ噬菌体 E.coli B PFU10-4 E.coli B PFU1λ噬菌体DNA被降解DNA被修饰E.coli B限制性核酸内切酶：降解外来DNA 防御修饰酶：DNA甲基化 保护寄主细胞控制的限制与修饰系统（R/M体系）！第2页，共34页。 一、限制酶的种类限制修饰活性酶蛋白结构相对分子质量切割位点切割作用辅助因子实用性代表Ι型酶 Ⅱ型酶 Ⅲ型酶同时存在 单独存在 同时存在多亚基结构 单亚基结构 两个亚基 30万dal 2-10万dal Ι 、Ⅱ之间 与识别位点不一致 与识别位点一致 与识别位点不一致 Mg2+、ATP、SAM Mg2+ Mg2+、 SAM 低 高 低 EcoK、EcoB Hind Ⅱ EcoPΙ第3页，共34页。 二、限制酶的命名命名原则限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小写）表示寄主物种菌株名位于其后 罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统 Haemophilus influenzae d HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ 属名 种名 株名 不同限制修饰系统 第4页，共34页。 三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’EcoR I的识别序列EcoR I的切割位点5‘ … G A G G C C G A G … 3’3‘ … C T C C G G C T C … 5’HaeⅢ的识别序列HaeⅢ 的切割位点第5页，共34页。 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧部分限制酶能识别多种核苷酸序列5‘ … G C G T Py Pu A C G A G … 3’3‘ … C G C A Pu Py T G C T C … 5’HindⅡ的识别序列Py dCMP、dTMPPu dAMP、dGMP第6页，共34页。 识别序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’EcoR I的识别序列EcoR I的切割位点回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构第7页，共34页。 三、Ⅱ型限制酶的特性-切割后形成的末端粘性末端：5‘ … GTGAATTCGA … 3’3‘ … CACTTAAGCT … 5’EcoR I5‘ … GTG AATTCGA … 3’3‘ … CACTTAA GCT … 5’平齐末端：5‘ … GAGGCCGAG … 3’3‘ … CTCCGGCTC … 5’5‘ … GAGG CCGAG … 3’3‘ … CTCC GGCTC … 5’HaeⅢ彼此具有互补核苷酸的单链延伸末端第8页，共34页。 三、Ⅱ型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶同尾酶:来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性 末端的一类限制酶5‘ … GTGGATCCGA … 3’3‘ … CACCTAGGCT … 5’BamH I5‘ … GTG GATCCGA … 3’3‘ … CACCTAG GCT … 5’5‘ … GTTGATCAGA … 3’3‘ … CAACTAGTCT … 5’ Bcl I5‘ … GTT GATCAGA … 3’3‘ … CAACT