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流式细胞术实验方法 PI 染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入 2ml 圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml 离心洗涤 1 次，弃上清。 3、加入 2ml 预冷的 70%酒精，4℃固定 30min，或是-20℃固定过夜。 4、离心，弃上清液。 5、用 1×PBS 1ml 洗涤 1 次，离心。 6、加入RNase A (工作浓度 20ug/ml)于 500ul 1×PBS 中，37℃孵育 30min，离心。 7、用 1×PBS 1ml 洗涤 1 次，离心。 8、加入PI(工作浓度 50ug/ml) 于 500ul 1×PBS 中，室温避光孵育 30min。 9、混匀，过 300 目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。 GFP PI 染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入 2ml 圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml 离心洗涤 1 次，弃上清。 3、加入 2ml 预冷PFA，PFA 的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定 30min。以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9） 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入 2ml 圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。 3、加入用PBA 稀释的荧光素标记的抗体 200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育 30min-1h。 4、离心弃上清液。 5、加入冷PBS1ml,离心洗涤 2 次，以除去未结合的多余抗体成分。 6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。 细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 3、 用 PBA 稀释的第一抗体 200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育 1、5-2h。离心，弃上清。 4、 BS1ml 离心洗涤 1 次，以去除多余的未结合的特异性抗体。 5、 PBA 适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育 30min，避光。 6、 PBS 1ml 离心洗涤 2 次。 7、将细胞重新悬浮于 500ulPBS 中，混匀，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待测。 胞内直接免疫荧光染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入 2ml 圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、用 1×PBS1ml 洗涤 1 次，离心。 3、4%PFA 1ml，4℃固定 30min。 4、用 1×PBS1ml 洗涤 1 次，离心。 5、0、1% Triton-100 1ml, 室温 10min。6、用 1×PBS1ml 洗涤 1 次，离心。 7、加入用PBA 稀释的荧光素标记的抗体 200ul，用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育 30min-1h。 8、离心弃上清液。 9、加入冷PBS1ml,离心洗涤 2 次，以除去未结合的多余抗体成分。 10、向细胞中加入冷PBS500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。 胞内间接免疫荧光染色操作步骤1-6、同胞内直接免疫荧光染色操作步骤 7、加入用 PBA 稀释的第一抗体 200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育 1、5-2h。离心，弃上清。 8、冷PBS1ml 离心洗涤 1 次，以去除多余的未结合的特异性抗体。 9、加入 PBA 适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育 30min， 避光。 10、冷PBA1ml 离心洗涤 2 次。 11、将细胞重新悬浮于 500ulPBS 中，混匀，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待测。 备注： 1、 RNase A： 贮液浓度：1mg/ml ； 工作液配制：加 1 mg/ml 贮液 10ul 于 500ul 1×PBS 中，使终浓度为 20ug/ml。2、PI： 贮液浓度：2、5mg/ml； 工作液配制： 加 2、5 mg/ml 贮液 10ul 于 500ul 1×PBS 中，使终浓度为 50ug/ml。3、PBA ： 即PBS 加 1-2% 牛血清白蛋白，加 0、1%叠氮钠。 4、检测样品细胞浓度 1x106 /ml。