RT-PCR检测血细胞中p53基因的表达.ppt

血细胞P53基因表达检测 ——RT-PCR 湘雅医检1501 2021/3/29 星期一1 P53基因P53基因命名该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质功能作用重要的抑癌基因，防止癌变细胞基因的修复功能 RT-PCRRT-PCR(反转录PCR技术) RNA的反转录（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 在GenBank中查找p53基因设计引物确定参数检测p53基因在血细胞中的表达反转录的引物五个主要问题基因表达的检测方法2021/3/29 星期一4 Ques2021/3/29 星期一5 在蛋白质水平基因检测的方法在DNA水平在MRNA水平Northern印记杂交RT-PCR....... Reverse Transcription PCR RNA提取cDNA反转录PCRNorthern 印记杂交Northern印记杂交基因表达水平随机六核苷酸引物引导Oligo(dT)引导特异性引导2021/3/29 星期一7 Ques2021/3/29 星期一8 反转录酶逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补 的双链cDNA. 反转录可用的引物010305 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。 随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。特异性引物：用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 Ques2021/3/29 星期一11 查找P53序列使用GENBANK，P53登陆号AH007667 查找P53序列 查找P53序列 查找P53序列 引物设计的原物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性产物不能形成二级结构引物长度一般在15~30碱基之间G+C含量在40%~60%之间碱基要随机分布引物自身及之间不能有连续4个碱基的互补引物5′端可以修饰引物3’端不可修饰引物3′端要避开密码子的第3位 Ques2021/3/29 星期一17 引物设计PRIMER PREMIER 5.0Primer?Premier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer?Design），酶切分析窗口（Restriction?Sites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引物设计功能。 引物设计1启动界面 引物设计2在此输入需扩增的DNA序列 引物设计3 引物设计4 引物设计5 引物设计6 引物设计7 引物设计8Hairpin：发夹结构Dimer：二聚体False Priming：错配Cross Dimer：交叉二聚体 引物设计9 引物设计10 引物设计11保存选择满意的引物 引物设计12所选引物 确定参数cDNA size:434bp94度 30秒变性155度 45秒退火273度 60秒延伸327次循环4 确定参数四项参数循环次数退火延伸变性模板DNA由双链变成单链，有利于与引物结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间，一般情况下94?C 30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性。变性的DNA快速冷却至40－60?C可使引物和模板DNA发生结合。可根据引物的长度和G＋C的含量选择复性温度一般是70－75?C，此时Taq DNA聚合酶活性最高。1kb，1分钟；1kb的可适当延长时间。理论上20－25个循环PCR产物的累计即可达到最大值、实际操作中25－30较合理。 确定参数退火温度：50℃~54℃ Ques2021/3/29 星期一34 检测基因的表达 根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶，取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳45－60min。成像系统成像分析。琼脂糖凝胶电泳分离产物： 检测基因的表达 1 2 3 4Marker（DNA分子量标准）cDNA假阳性对照（出现的PCR扩增条带一致，有时更整齐更明亮）假阴性对照（什么条带没有） 谢谢