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实验一显微摄影技术 第一页，共二十七页，2022年，8月28日 一、实验目的 1、了解光学显微镜结构原理并熟练掌握其操作方法； 2、掌握显微摄影技术操作流程，了解传统摄影技术中照片洗印操作流程； 3、了解暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、微分干涉差显微镜、倒置显微镜、等的构造和使用方法。 第二页，共二十七页，2022年，8月28日 二、实验原理 显微镜的放大效能是由其照明系统所使用光的波长和透镜系统的数值孔径决定，缩短使用的光波长或增加数值孔径可以提高分辨率。 可见光的光波振幅较窄，因此使用较短波长的紫外光作为光源系统，可以提高分辨率。而对于一台普通光学显微镜，一般来说，提高其分辨率主要通过提高数值孔径（选用镜口角大的透镜，提高介质折射率）。 第三页，共二十七页，2022年，8月28日 基础知识 显微镜概述： 显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。 1.光学显微镜 普通生物显微镜由3部分构成： ①照明系统：包括光源和聚光器。 ②光学放大系统：由物镜和目镜组成， 是显微镜的主体。 ③机械装置：用于固定材料和观察方便， 包括镜台(载物台) 、调节器和、 物镜转换器(旋转器)等。 尼康E-600显微镜 第四页，共二十七页，2022年，8月28日 光学显微镜基本结构： 1. 照明灯(Lamp) 2. 聚光器(Condenser) 3. 载物台和切片夹(Mechanical stage and specimen retainer) 4. 推进器(Mechanical stage adjustment knob) 5. 物镜(Objectives) 6. 粗细螺旋(Course and fine focus knob) 7. 目镜(Oculars) 8. 照相机等接口(Connection to camera, etc.) 第五页，共二十七页，2022年，8月28日 2.荧光显微镜 尼康E800荧光DIC显微镜 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 第六页，共二十七页，2022年，8月28日 荧光显微镜(Fluorescence microscope) ： 以紫外线为光源,用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。 用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 第七页，共二十七页，2022年，8月28日 3. 激光共聚焦扫描显微镜 LCSM照片 蓝色为细胞核，绿色为微管 第八页，共二十七页，2022年，8月28日 用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。 系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。 　激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 第九页，共二十七页，2022年，8月28日 4.暗视野显微镜 暗视野显微镜（dark field microscope）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 5.相差显微镜 一种介壳虫的染色体 第十页，共二十七页，2022年，8月28日 相差显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(振幅差)，这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。 相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。 第十一页，共二