蛋白质的共价结构 .pptVIP

（二）、末端氨基酸残基的鉴定 、 末端分析 2 C C末端AA α氨基醇 水解肽链，鉴定α氨基醇 ② 还原法 硼氢化锂 第六十二页，共一百零八页，2022年，8月28日 肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解 根据不同反应时间释放出的AA种类和数量 蛋白质C-末端残基顺序。 四种羧肽酶：A,B,C和Y； A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母) ∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基 ∽B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键 ∽Y：可作用于任何一个C-末端残基的肽键 ③羧肽酶法 （二）、末端氨基酸残基的鉴定 、 末端分析 2 C 第六十三页，共一百零八页，2022年，8月28日 （三）、二硫键的断裂 盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价力。 应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。 第六十四页，共一百零八页，2022年，8月28日 1、酸水解 常用6M盐酸或4M硫酸 优点：水解产物不消旋 缺点：Trp被沸酸完全破坏 含羟基Ser、Thr、Tyr部分分解 Asn、Gln酰胺基被水解 （四）、氨基酸组成的分析 第六十五页，共一百零八页，2022年，8月28日 2、碱水解 一般用5M氢氧化钠 缺点：许多AA受到不同程度的破坏 部分水解产物发生消旋化 优点：Trp不受破坏 （四）、氨基酸组成的分析 第六十六页，共一百零八页，2022年，8月28日 1、酶解法: 内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶 多肽链的选择性降解 （五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化 目前序列分析方法最长只能几十个残基，因此需要裂解多肽，然后分离纯化。 第六十七页，共一百零八页，2022年，8月28日 R1=Lys（K）或Arg（R） 专一性较强，水解速度快 R2=Pro（抑制） 肽链 水解位点 胰蛋白酶trypsin 减少断裂点： 保护Lys侧链ε-NH2或修饰Arg胍基 增加断裂点： 将Cys变为类似Lys的结构 第六十八页，共一百零八页，2022年，8月28日 R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA Leu、Met和His稍慢 R2=Pro（抑制） pH8-9 肽链 水解位点 糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin） 水解速度与相邻AA性质有关: 酸性：-/碱性：+ 第六十九页，共一百零八页，2022年，8月28日 R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快 肽链 水解位点 R2= Pro或Gly，不水解 R1或R3=Pro，抑制水解 嗜热菌蛋白酶（thermolysin) 第七十页，共一百零八页，2022年，8月28日 R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、 Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 R1=Pro（抑制） pH2 肽链 水解位点 胃蛋白酶Pepsin 第七十一页，共一百零八页，2022年，8月28日 肽链 水解位点 羧肽酶和氨肽酶 第七十二页，共一百零八页，2022年，8月28日 2、化学裂解法 ①溴化氰水解法(Cyanogen bromide) ——选择性地切割由Met羧基形成的肽键。 （五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化 多肽链的选择性降解 第七十三页，共一百零八页，2022年，8月28日 ②NH2OH断裂： 较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键 Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂 第七十四页，共一百零八页，2022年，8月28日 3、肽段的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法 第七十五页，共一百零八页，2022年，8月28日 N-端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 1、 Edman法 （六）、肽段氨基酸序列的测定 （苯异硫氰酸酯法） Edman于1950年首先提出。 第七十六页，共一百零八页，2022年，8月28日 多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序 含游离?-氨基的一端：氨基端或N-端 含游离?-羧基的一端：羧基端或C-端 AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点 如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 反过来写的是一个不同的肽 第三十页，共一百零八页，2022年，8月28日 肽键是aa间的基本连接方式。证据： １、Pr中游离α－