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DNA 重组实验中常用的技术 一、质粒 DNA 的提取及鉴定 （一）质粒 DNA 的提取及鉴定1．收获细菌 将2ml 含相应抗生素的 LB 液体培养基加入到通气良好的 15ml 的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。 将 1.5ml 培养物倒入 1.5ml 离心管中，用台式离心机于 4℃以 12000g 离心 5min，将剩余的培养物贮存于4℃。 吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 2．碱裂解法小量抽提质粒 将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于 100μl 预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L 葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。 加 200μl 新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴 5min。 加 150μl 预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸 11.5ml,水 28.5ml），缓和振荡，冰浴 5min。 （4）4℃以 12000g 离心 5min，将上清转移到另一离心管中。 可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4）。 用 2 倍体积无水乙醇室温沉淀双链 DNA，振荡混合，于室温放置 2min。 （7）4℃以 12000g 离心 5min。 小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。 用 75%乙醇于 4℃洗涤 DNA，同上离心去上清真空抽干。 加 50μl 的 1×TE（含 20μg/ml 无 DNA 酶的胰 RNA 酶），振荡，贮存于-20℃。 （二）质粒 DNA 的大量制备 （1）同上 1.（1） 将 1ml 含菌液倒入含相应抗生素的 Lb 100ml 中，37℃振荡培养至 A590=1.0(5～6h)。 加氯霉素（170μg/ml）扩增，37℃温箱中培养过夜。 收集菌液于离心管中，冰浴 10min。3000rpm,离心 10min，去上清。 加溶液Ⅰ5ml 悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。 加溶液Ⅱ10ml 轻轻混匀，室温下 5min。 加溶液Ⅲ7.5ml 轻轻混匀，冰浴 30min。15000rpm，4℃离心 20min。 取上清液于高速离心管中，加 2 倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。 （9）15000rpm 4℃ 离心 20min。 弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干（10～15min）。 用 5ml1×TE 溶解，加入 RNase A 15～20μl，42℃水浴 4h 于过夜。 加入 5ml 饱和酚，混匀，4000～5000rpm 离心 5min，取上清液入 5ml 离心管内。 分别加入 2.5ml 饱和酚，2.5ml 氯仿，混匀后同样离心收集上清。 加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，同样离心收集上清。 加入 1/10 体积的 3mol/l NaAc 及 2 倍体积的无水乙醇于-20℃3～5h。 （16）10000rpm 4℃离心 20min。 弃上清，加入 75%乙醇洗涤 2 次。 离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE 溶解质粒 DNA。 （三）质粒 DNA 的鉴定1．酶切反应 在 0.5ml Eppendorf 管中加重蒸水 6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶 1μl，混匀，37℃水浴 1h 以上。 取反应物点样，观察酶切效果。 酶切完全后，70℃5min 终止反应。 2．琼脂糖电泳 配制所需浓度琼脂糖凝胶。 在待测的 DNA 样品中加 1/5 体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。 打开电源开关，5V/cm 电泳。 在 UV 灯下观察电泳结果。二、DNA 的重组 （一）DNA 的酶切与连接 酶切反应 同质粒 DNA 的鉴定，只不过是质粒 DNA 换为载体 DNA。若大量酶切，则成比例增加。 加 2 倍体积的预冷无水乙醇和 1/10 体积的 3mol/l NaAc 混匀，-20℃2h 以上。 （3）15000rpm 离心 15min，弃上清。 加入 75%乙醇洗涤 2 次，离心弃上清，真空抽干。 加入适量 1×TE 溶解。如此可得线性化载体 DNA。 测定 DNA 的含量。 加入线性载体 DNA 和含量 3～4 倍于载体的待插入 DNA 片段，连接缓冲液及T4 连接酶适量至总体积为 20μl，在 12～14℃反应 12～16h。 连接反应液可置-20℃保存，供转化用。 关于待插入 DNA 片段的获得参见附注。 （二）大肠杆菌感受态的制备及重组DNA 的转化 1．感受态的制备 （1）接种单菌落于 2ml LB 培养液中， 37℃过夜。 （2）取 0.25ml 过夜菌入 25ml LB 培养液中，37℃振摇 4～6h 至 A590=0.4～0.6。 倒入 50ml 管内，水浴 10min