感染性疾病的分子诊断课件.pptVIP

第八、九章感染性疾病的分子诊断;感染的慨念;感染性疾病：由某种病原体所致，通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病。 病原体：病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、寄生虫 。 ;常规检测方法： 免疫学方法 微生物学方法 受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信息。;感染性疾病的分子诊断策略;感染性疾病分子诊断标志物;二、感染性疾病分子诊断的常用方法;;nucleic acid sequence-based amplification (NASBA);NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。　 ;;nucleic acid sequence-based amplification (NASBA);NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。　 ;三、感染性疾病分子诊断的标本处理;四、感染性疾病分子诊断的结果解释;3. 定性检测结果 有时不能提供病原体活力相关信息 临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者样本中仍可以检测出相应的病原体。 有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。 4. 疾病状况的判断 检测出病原体的存在并不能说此病原体就是引起疾病的直接原因。 该病原体可能是一种正常菌群 ;五、感染性疾病分子诊断的临床应用及评价;第一节 病毒的基因检测; 我国是HBV高流行区，50%－70%的人受过感染，8%－10%是HBV携带者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬变，HBV又与原发性肝癌密切相关。 外壳（HBsAg): 外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)： DNA DNA 聚合酶 HBcAg;Dane颗粒（完整的病毒）形态;（一）病毒基因组结构;pre-s1 ;HBV 基因分型;HBV在肝细胞内的复制;（二）分子诊断;扩增位置 引物序列 扩增片断（bp) P、X基因 5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’ 278 5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’ C基因 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’ 477 5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’ C基因 5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’ 258 5’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’ ; 有时为了证实扩增产物的特异性，对扩增产物进行以下分析： RLFP 斑点杂交 Southern杂交 ;2. 支链DNA信号放大技术(bDNA）;捕获探针固化在微孔板上 靶探针1分别与捕获探针及待测核酸杂交 靶探针2分别与待测核酸及bDNA杂交 形成复合物：;;信号检测：bDNA可结合很多酶标探针，酶催化底物（1,2-二恶二酮，dioxetane）发光，使核酸信号放大，且发光强度与DNA量成正比。 优点：放大倍数确定 阳性检出率高 稳定性和可重复性好 操作简便，省时，易于普及;3.基因芯片技术 标本经PCR扩增后与芯片上的特异探针进行杂交，可以检测： 是否有病毒感染 感染病毒的种类及亚型 病毒的耐药情况 特点：可同时进行大量标本的检测;近年来陆续上市的核苷(酸)类似物对HBV的治疗压力集中在P区。;YMDD (酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸) ;HBV耐药检测（ YMDD突变检测方法）;YMDD突变检测方法;（三）临床意义;2.监测治疗效果: HBVDNA107拷贝/ml提示病毒复制活跃； HBVDNA＜104拷贝/ml治疗有一定疗效； HBVDNA＜103拷贝/ml、HBeAg阴转、转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标； 3.判断病情，指导制定合理的治疗方案; 4.病毒耐药性的检测 乙肝病毒DNA聚合酶YMDD处的突变是病毒产生耐药性的重