分光光计测定大曲中糖化酶活性.pptxVIP

分光光计测定大曲中糖化酶活性第1页/共12页第2页/共12页我国大多采用次碘酸盐法测定糖化酶活力方法存在速度慢，操作繁琐等缺 点，本文研究利用分光光度计测量 3，5一二硝基水杨酸与还 原糖显色反应的吸光度值，并根据吸光度值 与还原糖含量的相关关系确定糖化酶活力，以期找到一种快速、准确测定大曲糖化酶活力的方法。第3页/共12页实验方法糖化酶活力测定原理 酶活力定义 ：1g酶液在 40℃、pH4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产lmg葡萄糖的酶量定义为 1个酶活力单位。 测定原理：淀粉经糖化酶水解为葡萄糖，3，5一二硝基水杨酸 (DNs)与葡萄糖共热后被还原成棕红色的 3一氨基一5硝基水杨酸，在波长 520nm 处，3一氨基-5硝基水杨酸有强的光吸收。在一定浓度范围内，反应液的吸光度值与葡萄糖的量呈正比，即反应液的吸光度值与糖化酶活力成正比。 第4页/共12页标准曲线制作：准确称取酶活为 861.9U／g的大曲 1.6g，定容至 25mL 容量瓶中。取 6个 50mL比色管，分别加入 2％淀粉溶液 25mL，0.1mol／L乙酸 -乙酸钠缓冲液 5mL，蒸馏水2.0mL、 1.6mL．1.2mL．0.8mL、0.4mL、0mL，摇匀，40℃水浴5min。 依次加入液体糖化酶稀释液 0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、 1.6mL、2.0mL到比色管中，立即计时，反应 30min。分别向 比色管中添加20％NaOH0.2mL，迅速用水冷却，终止酶反应。 分别取 5mL反应液，用蒸馏水定容至 100mL，取 0.5mL 稀释反应液到试管中，加入 0．5mL DNS，沸水浴 3min。分 别向试管中加 8mL蒸馏水，在波长 520nm 处比色。 第5页/共12页大曲糖化酶活力测定糖化液、空白液的反应方法和国标一样，就后面测定方法不一样。测定方法：分别取 5mL反应液（糖化液、空白液），用蒸馏水定容至 100mL，取 0.5mL 稀释反应液到试管中，加入 0.5mL DNS，沸水浴 3min。分别向试管中加 8mL蒸馏水，在波长520nm 处比色。根据样品吸光度值在标准曲线上查出对应的糖化酶活力。 第6页/共12页结果与讨论不同浓度葡萄糖溶液与DNS共热后的吸光度值见表 1。以酶活力为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线见附图。 由附图可知，在一定酶浓度范围内，反应液的吸光值与糖化酶活力成正比，其关系式为：Y=0．000630X(式中x为糖化酶活力：Y为吸光度值)。 第7页/共12页表 1不同酶活力的吸光度值 第8页/共12页加标回收向样品中加入 lg已知酶活为 861．9U／g的大曲，反应测定糖化酶酶活力的变化，结果见表 2由表 2可知，用分光光度法测定糖化酶酶活加标回收 率为 95.0%-105%，相对标准偏差1.045％，符合分析 方法中的规定。 第9页/共12页表 2 糖化酶酶活力的回收率 第10页/共12页对照实验取 1g活力为 861.9U／g的酶液，分别用分光光度计法和碘量法测定糖化酶活力，结果见表 3。由表3可知，分光度计法与碘量法测定的精确度基本相当。 第11页/共12页结论实验表明，糖化酶水解淀粉产生的葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸 (DNs)反应生成的棕红色 3-氨基 5-硝基水杨酸，在 520nm 波长处的光吸收强度与糖化酶活力呈正比，可采用分光光度计法测量大曲的糖化酶活力。当吸光度值为 0．2～0．5时，实验误差1％。分光光度计法与碘量法测定大曲糖化酶活力的精度基本相当，但分光光度计法比碘量法步骤少，操作简单，可以实现快速测定。 第12页/共12页感谢观看！