《小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术规范》.pdfVIP

DB32/T XXXX—2019 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：邢宇俊、仇剑波、董飞、徐剑宏、史建荣、吴季荣、陆丹丹。 I DB32/T XXXX—2019 小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术规范 1 范围 本标准规定了小麦产毒镰刀菌种群以及产毒素化学型区分中镰刀菌DNA的提取、PCR扩增、电泳 检测及结果判定方法和操作规范。 本标准适用于产毒镰刀菌种群及产毒化学类型的定性PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.15 食品安全国家标准 食品微生物检验 霉菌和酵母计数 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 产毒镰刀菌经过提取DNA 后，利用特异性区分引物，通过普通PCR 判断该样品是否为禾谷镰刀 菌或亚洲镰刀菌。根据关键特异基因Tri11来区分该样品是否产生3ADON、15ADON 或者雪腐镰刀烯 醇NIV 化学型。 4 试剂和材料 4.1 水：应符合GB/T 6682 中一级水的规格。 4.2 PDA 培养基：按GB4789.15规定。 4.3 CTAB 缓冲液:55mmol/L CTAB、1400mmol/L 氯化钠 （NaCl）、20mmol/LEDTA、100mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），121℃高压灭菌20min，储存于2℃～8℃。 4.4 TE 缓冲液。 4.5 RNA 酶溶液 （5μg/μL）。 4.6 蛋白酶K （20mg/mL）。 4.7 Tri 饱和酚。 4.8 酚：三氯甲烷：异丙醇 （25：24：1）；三氯甲烷：异戊醇 （24：1）。 4.9 异丙醇。 4.10 区分禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌引物 Fg16F:5′-CTCCGGATATGTTGCGTCAA-3′ Fg16R:5′-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3′ 预期亚洲镰刀菌扩增片段大小为497bp；预期禾谷镰刀菌扩增片段大小为410bp。 4.11 区分3A-DON、5A-DON 和NIV 化学型引物 1 DB32/T XXXX—2019 Tri11-CON:5′-GACTGCTCATGGAGACGCTG-3′ Tri11-3ADON:5′-TCCTCATGCTCG GTGGACTCG-3′ Tri11-15ADON:5′-TGGTCCAGT TGTCCGTATT-3′ Tri11-NIV:5′-GTAGGTTCCATTGCTTGTTC-3′ 预期产3ADON 毒素类型扩增片段大小为334bp；产15ADON 毒素类型扩增片段大小为279bp ；产NIV 毒素类型扩增片段大小为497bp。 4.12 无水乙醇。 4.13 DNA Ladder：可以清楚区分100bp～1000bp 的DNA 片段。 4.14 dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L 的dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液 等体积混合。 4.15 TaqDNA 聚合酶、PCR 扩增缓冲液及25mmol/L 氯化镁溶液。 4.16 50×TAE 缓冲液：称取484gTris，量取114mL 冰乙酸，200mL 0.5mol/L EDTA，溶于水中，定 容至2L。分装后高压灭菌备用。使用时用水稀释成1×TAE 电泳缓冲液 （工作液）。 4.17 加样缓冲液。 4.18 琼脂糖。 4.19 溴化乙锭。 5 主要仪器和