DB15T 2022—2020牛和马源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法.docxVIP

ICS 07.080 CCS A 40 内 蒙 DB15 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2022—2020 牛和马源性成分同步检测方法 实时荧光 PCR 法 Real-time PCR Method for Authentification of Cattle and Horse Derived Materials 2020-10-20 发布 2020-11-20 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由锡林郭勒职业学院、 锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中心提出。 本文件由内蒙古自治区肉乳标准化技术委员会 (SAM/TC 39) 归口。 本文件起草单位：锡林郭勒职业学院、锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中心。 本文件主要起草人： 郭梁、罗建兴、徐伟良、其勒木格、郭元晟、李春冬、刘国强。 牛和马源性成分同步检测方法 实时荧光 PCR 法 1 范围 本文件描述了动物产品(肉、乳)中牛和马源性成分的实时荧光PCR检测方法。 本文件适用于鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品中牛和马源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件， 其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光 PCR real time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时检测整个PCR过程， 对未知模板进行 定性或定量分析。 3.2 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.3 阳性对照 positive control 用已知含有牛和马源性成分的样品作阳性对照。 3.4 阴性对照 negative control 用已知不含有牛和马源性成分的样品作阴性对照。 3.5 空白对照 blank control 用等体积的灭菌水代替模板DNA作空白对照。 4 原理 利用不同荧光基团标记特异性牛和马探针以及质控探针， 采用多重实时荧光PCR技术，对提取于 鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品的DNA进行扩增。在同一反应中对牛和马特异基因以及质控基 因同时扩增，三种荧光同时检测。其中，同管质控探针的检测旨在监控扩增反应是否正常进行，避 免假阴性结果。通过评价Ct值判断动物产品(肉、乳) 是否含有牛和马源性成分。 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水为符合GB/T 6682规定的一级水。 5.1 三氯甲烷。 5.2 异戊醇。 5.3 异丙醇。 5.4 95%乙醇。 5.5 75%乙醇。 5.6 CTAB 提取液：称取 10 g CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)、 40.6 g NaCl、6.06 g Tris base (三羟甲基氨基甲烷)、 3.94 g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠) ，加入 800 mL 的水， 在 65 ℃水浴 加热溶解， 用 HCl 调节 pH 至 8.0，加水定容至 1000 mL，在 121 ℃条件下， 灭菌 30 min。使用前加 入终浓度为 2%的 β -巯基乙醇。 5.7 乳化剂：量取 20 mL Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚， 90%)、 125 mL 乙醇(95%) 、855 mL NaCl 溶液 (0.9 g/L) ，加水定容至 1000 mL，在 121 ℃条件下， 灭菌 30 min。 5.8 PBS 缓冲液(磷酸缓冲液) ：称取 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4，加 入 800 mL 水溶解， 用HCl 调节 pH 至 7.4，加水定容至 1000 mL，在 121 ℃条件下， 灭菌 30 min。 5.9 实时荧光 PCR 反应混合液：1 U~2 U 的 Taq酶、 1×PCR 缓冲液、 2.5 mmol/L~4.0 mmol/L 的 Mg2+ 、0.2 U~1 U 的 UNG 酶、 0.2 mmol/L 的 dNTP。也可以使用同等效果的商品试剂盒。 5.10 牛和马源性成分扩增引物和探针详见表 1。 表1 引物和探针序列 名称 序列(5’~ 3’ ) 目标基因/大小 正向引物 TTGAATYAGGCCATGAA