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兰州大学基因工程基因工程酶学基础第1页/共112页第2页/共112页第二章 基因工程的酶学基础第3页/共112页第一节 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶第4页/共112页1、来源及发现 主要来源于原核生物 1968年，Dr. Werner Arber, Dr. Daniel Nathan和Dr. Hamilton Smith博士第一次从大肠杆菌中提取出限制性内切核酸酶已经分离提取出500多种限制性内切核酸酶Dr. Werner Arber第5页/共112页2 性 质 内切酶，即在核酸分子内部制造切口的酶 形成5`-P 和3`-OH末端3 功 能 自我保护作用细菌的限制和修饰系统（R/M体系）第6页/共112页a 限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA分子进行分解，切成小片段AABBBBB第7页/共112页b 修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割 第8页/共112页c 限制修饰系统分子机理由三个连续基因位点所控制： hsd R, hsdM,? hsd S hsd R---限制性内切酶:能识别DNA分子上的特定位点并将双链DNA切断hsd M---限制性甲基化酶 :催化DNA分子特定位点上的碱基甲基化反应hsd S---控制两个系统的表达 :协助上述两种酶识别特殊的作用位点第9页/共112页宿主细胞内的甲基化酶将自身DNA和噬菌体DNA实施特异性保护，封闭了自身限制性酶的识别位点这种限制不完全，总有少数入侵DNA会存活，得以在宿主细胞内复制，并被宿主的甲基化酶修饰，但同时，也丧失了原宿主甲基化酶标记第10页/共112页d 意义寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过程，广泛存在于原核细菌中。有两方面作用：保护自身DNA不受限制 破坏外源DNA，使之迅速降解第11页/共112页二 限制性内切酶的命名命名：EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：酶编码基因所在质粒；Ⅰ：发现次序)第12页/共112页三 限制性内切酶类型目前鉴定出3种不同的限制性内切酶I 型限制性内切酶II型限制性内切酶Ⅲ型限制性内切酶第13页/共112页特性I型II型III型限制和修饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶? 具有一种共同亚基的双功能的酶核酸内切限制酶的蛋白质结构3种不同的亚基单一的成份? 2种不同的亚基? 切割位点在距寄主特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割位于寄主特异性位点或其附近?距特异性位点3，端24~26bp处甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位 点识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割? 能?能能不是是是序列特异的切割DNA克隆中的用处无用十分有用用处不大限制性内切酶的类型及其主要特性 第14页/共112页 II型限制性内切酶的基本特性1970年，由H. O. smith和K. W. wilcox 从流感嗜血菌中分离得到 如Hind II（1）识别位点 未甲基化修饰的特异靶序列，多数呈中心对称的回文结构，由4-8个碱基组成，有些识别位点是连续的，有些则是间断的，如GANTC第15页/共112页（2）切割位点绝大多数II类酶在其识别位点内切割DNA第16页/共112页粘性末端 （cohensive end） 连接便利第17页/共112页第18页/共112页 DNA 分子末端标记 平末端补齐第19页/共112页一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖第20页/共112页 同裂酶 (isoschizomers)： 来源不同，识别的是同样的核苷酸靶序列第21页/共112页第22页/共112页同尾酶(isocaudamer) ：来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，在基因克隆实验中很有用处第23页/共112页由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，称之为“杂种位点”(hybrid site)。但这类杂种位点的结构，一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别第24页/共112页影响限制性内切酶活性的因素1、DNA的纯度2、DNA的甲基化程度3、酶切反应的温度4、DNA的分子结构5、核酸限制性内切酶的反应缓冲液第25页/共112页DNA的纯度第26页/共112页第27页/共112页DNA的甲基化程度原核生物限制—修饰体系，对识别序列中特定核苷酸的甲基化，会强烈影响酶活性。在基因克隆中使用