聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法.docxVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法 (一)管型盘状电泳 仪器和设备 图 8 管型盘状电泳槽结构 A 为正面 B 为剖面 分离胶PH8.9 (2)浓缩胶PH6.7 (3)电极缓冲液PH8.3 电泳槽：盘状电泳槽国内有很多单位生产，也可因地制宜，自己制造，槽大多为圆筒形(图 9)，也有长方形的，上、下槽分别接铂金丝电极，要注意电极到各胶管的距离相等，以保持各凝胶管的电场一致。 电泳仪：国内生产的型号很多，如北京六一仪器厂的DYY-Ⅲ型，电压在 0～600v 内任意调节，电流输出 0～100mA，这类电泳仪比较恰当。 玻璃管：选择粗细均一的圆玻璃管，内径5～7mm 左右，管长 70～100mm。管口用金刚砂磨平，电泳管的清洁很重要，需浸入10%重铬酸盐-硫酸溶液中清洗，再用蒸馏水彻底淋洗干净，在管中滴入丙酮而后干燥备用。 聚胶架：普通试管架式样，有机玻璃制成，架的孔洞内装一乳胶管，要求乳胶管孔内径与玻璃管外径相同或略小。 微量注射器或微量进样器：加样时，由于需样品量极小，作定量分析时要求样品量准确，因此最好用 25.50 或 100μl 的微量进样器加样，也可用 50 或 100μl 加液器代用。 普通注射器：主要用于灌胶和剥胶，20～30ml，附加 10 号不锈钢长针头(约 10cm 长)。 其他：日光台灯，PH 计，恒温水浴，烧杯，容量瓶，量筒，试管，漏斗，滤纸，电炉，电子天平等。 试剂 甲叉双丙烯酰胺(Bis)；丙烯酰胺(Acr)；四甲基乙二胺(TEMED)；过硫酸铵；核黄素(VB2)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；蔗糖；甘氨酸；盐酸等。 丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺产品不纯时需要纯化后才能使用。 丙烯酰胺纯化法：70g 丙烯酰胺溶于 500ml 氯仿中(50℃)，热滤，滤液凉后置-20℃冰箱，即有结晶析出，砂芯漏斗过滤，收集结晶。结晶置于真空干燥器中减压干燥，贮棕色瓶中备用。 甲叉双丙烯酰胺纯化法：12g 甲叉双丙烯酰胺溶于 100ml 40～50℃丙酮，加热过滤，滤液置-20℃冰箱，结晶析出后过滤，并置于真空干燥器中干燥，保存于棕色瓶中备用。 试剂配制 凝胶及缓冲液配制系统 有关资料很多，可以根据需要选择适宜的系统。列表 4 供参考。最常用的是系统 1(所谓 Davis 的标准状态)。各种贮存液配制后，盛于棕色瓶中，贮冰箱备用。用时需测 PH 值，以检查是否失效。TEMED 要密封贮藏。过硫酸铵溶液最好现用现配，不宜超过一周。 1mol/l HCl1mo;/L 1mol/l HCl 1mo;/L HCl 1mol/L KOH 1mol/l KOH 48.0ml 48.0ml 48.0ml 12.0ml Tris 36.3 Tris 6.85 克 醋酸 17.2 mlT 醋酸.25ml 1 8.9 15 7.5 17 4.3 20 2.9 克 EMED TEMED TEMED TEMED 4.0ml 0.46ml 1.15ml 0.46ml 丙烯酰胺 丙烯酰胺 丙烯酰胺 过硫酸铵 28.0 克 30.0 克 60.0 克 2a 8 2 6 8 21 2.8 克 双丙烯酰胺 双丙烯酰胺 0. 双丙烯酰胺 0. 0.735 克 8 克 4 克 过硫酸铵 1N H PO 3 4 过硫酸铵 1N KOH 0.14 克 39.0ml 0.28 克 48.0 升 3 16 5.5 18 22 5.9 Tris 4.95 克 醋酸 2.95m TEMED 0.46ml l DIV align=center 系统Ⅰ 系统Ⅱ 系统Ⅲ 系统Ⅳ (PH 值 8.9)(7.2%) (PH 值 7.5)(7.5%) (PH 值 4.3)(15%) (PH 值 2.9)(7.5%) 溶 组份/100 m PH 溶 PH 溶 PH 溶 PH 液 液 组份/100ml 液 组份/100ml 液 组份/100ml l 号 值 号 值 号 值 号 值 1N HCl 1N KOH 48ml 48.0ml Tris 5.98 4a 克  6.7 19 醋酸 2.87ml TEMED  6.7 TEMED 0.46ml 0.46ml 丙烯酰胺 10.0 克 5  6.7 双丙烯酰胺 2.5 克 核黄素 6 4.0mg 蔗糖 7 40.0 克 电极缓冲液： 电极缓冲液： 电极缓冲液： 电极缓冲液： Tris 6.0 克 甘氨酸 28.8 克 二乙基巴比妥 5.82 克 8.3 Tris 1.0 克 7.0 β -丙氨酸 32.2 克 醋酸 8.0 克 4.5 甘氨酸 28.1 克 醋酸 3.06ml 4.0 加水至 1 升 加水至 1 升 加水至 1 升 加水至 1 升 使用：10%稀释液 使用：10%稀释液 使用：10%稀释液 电极：上槽接负极Θ 电极：上槽接负极Θ