哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111.pptxVIP

哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111;一、 实验目的 1、了解真核细胞中基因组结构与组成的复杂性；学会 并掌握从哺乳动物组织中提取基因组总DNA的原理 与技术，为PCR分析，RFLP分析，基因文库的构 建，基因检测等研究打下基础； 2、学习与掌握PCR扩增基因的原理和操作方法，了解 PCR基因扩增技术在分子克隆，目的基因检测，遗 传病的基因诊断，法医学，考古学等方面的应用。;二、实验原理;;模板DNA在94℃条件下变性形成单链； 在55℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；72℃下在耐热性DNA聚合酶Taq 酶催化下， 在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的DNA为模板进行同样反应，如次往复循环30次，由于每次循环目标DNA都以２n次幂扩增，30次循环后目的DNA的量增加106～7倍。成功的PCR反应要求反应有很好的特异性和相当的扩增效率。 要达此目的PCR反应要注意以下问题： ①DNA模板：反应中DNA量在50 ng～200 ng左右。且DNA纯 度较高，以增加反应特异性。 ②dNTP:反应体系中达100μM～200μM。;③Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0 mM左右，浓度太低Taq 酶活力降低；太高反应特异性降低； ④引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20 nt左 右，Ｇ＋Ｃ含量在40 ％～70％之间，引物内部不能有回文 序列，引物３’端不能互补； ⑤Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性 DNA 聚合酶， 在95℃时30 min还有50％活力； ⑥变性温度：在93～95℃之间使模板充分变性。 ⑦复性温度：55℃左右，此温度选择是根据模板和引物配 对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因素。 ⑧延伸温度：70～72℃，为 Taq 酶最适反应温度。;三、实验仪器、材料与试剂 1、实验仪器与材料： 台式高速冷冻离心机，恒温水浴，真空泵，PCR仪，台式冷冻离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统，凝胶成像系统，冰箱、微量移液器、组织匀浆器，制冰机，一次性使用塑料手套和乳胶手套，猪肝组织。 2、实验试剂： 细胞裂解缓冲液 [10 mM Tris-Cl (pH 8.0),1 mM EDTA (pH 8.0), 1% SDS]，70% 乙醇，异丙醇，醋酸钾(pH=4.8) [60ml的5mol/L KAc, 11.5mL 冰醋酸，28.5 ml H2O]，TE (pH 8.0)或无菌水，无DNase的RNase A (10mg/ml)，蛋白酶K(20 mg/mL)； TaKaRa Taq (5U/ ?L)，10×PCR Buffer (Mg2+ Plus)，dNTP Mixture (each 2.5 mM)，猪肝基因组DNA，引物（Forward primer and Reverse primer)。;四、实验操作步骤 （一）、猪肝组织DNA的抽提 1、切下10-20 mg 组织，在液氮中碾磨成粉末。 2、将粉末转入1.5 mL 离心管中，加0.6 mL 细胞裂解 缓冲液和3 μL 蛋白酶K，混匀，置于55 ℃水浴中3 h 以上,但不要超过16 h。 3、消化液降至室温，然后加入 2 μL无DNase的RNase A，混匀。37 ℃水浴中放置0.5 h。 4、将样品降至室温，加入 200μL 醋酸钾溶液，剧烈震荡 20 sec 使其充分混合。冰上放置5 min。 5、12000 g 离心 5 min （4 ℃ ）。;6、将上清液转移到一个新离心管中，加0.6 mL 异丙醇。 充分混匀， 12000 g 离心 5 min （4 ℃ ）。 7、去掉上清，加入0.6 mL 70% 乙醇。颠倒离心管数次， 12000 g 离心 1 min（4℃）。 8、去掉上清，空气中干燥 DNA沉淀 15 min。 9、将DNA沉淀溶解于 100 μL TE 或水中。 10、浓度和纯度测定： OD260/OD280= 1.8-2.0； 1 OD260= 50 μg/ mL ;;2、在0.5ml薄壁管中，依次加入以下各成分： ddH2O: 18.0 ?L 10×buffer: 2.5 ?L dNTPs(2.5 mM) 1.0 ?L Forward primer (10?M) : 1.0 ?L Reve