引物纯化方式HAP、PAGE、DHLPC的区别.docVIP

引物纯化方式HAP、PAGE、DHLPC的区别 引物纯化方式HAP、PAGE、DHLPC等的区别 纯化方式: 一 OPC纯化 OPC纯化是使用一种叫Cartridge的反向层析柱(美国 Waters 公司生产 ),根据DNA保护基(DMTr基)和层析柱中树脂间的亲和力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于90%，适用于PCR用引物，DNA测序用引物，各种探针等。此级别对短链较为有效。 具体操作方法如下。 1. DNA 合成是用全自动 DNA 合成仪从 3‘ ? 5‘ 进行人工合成的。在刚合成完的 DNA 的 5‘ 端的碱基上带有一个 大型的疏水性保护基团 DMTr 基，而中间产物的短链杂质 DNA 中不具有 DMTr 基。利用这一性质进行目的 DNA 的纯化。 2. 把粗样 DNA 加入 Sep-Pak Cartridge 柱上(简易反相柱 ) 。此时，所有的合成产物全吸附于反相柱上。 3. 用甲醇清洗反相柱。此时，吸附能力强的带有 DMTr 保护基的目的 DNA 仍吸附于反相柱上，而短链杂质 DNA 片段全部被冲走。 4. 向反相柱上加入强酸 TFA (Trifluoroacetic acid) , 切断 DMTr 保护基和目的 DNA 之间的连接。 5. 再用乙腈洗脱目的 DNA 。此时回收出来的目的 DNA 的纯度能达到 95% 以上 。可用于 DNA 测序等。 二 PAGE纯化 PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的纯度大于95%，对长链Oligo DNA的纯化特别有效。适用于PCR用引物，DNA测需用引物，各种探针等。 三 HPLC纯化 采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，可达99%。适用于各种基因工程试验，特别是:荧光标记DNA、长链DNA、PCR克隆，定点突变，人工合成基因等。 HPLC 纯化 HPLC 纯化是使用高效液相色谱仪，对目的 DNA 片段进行纯化的方法。 HPLC 纯化的设备投资大，生产成本高，但使用本法纯化的 DNA 片段纯度极高，大于 99% 。 HPLC 纯化的操作方法如下。 1. 合成高纯度级 DNA 制品时，在全自动 DNA 合成仪上，需自动脱去 DMTr 保护基。 2. 将粗样 DNA 注入分离性能极强的离子交换高效液相色谱系统，进行粗检测，确认主峰位置、目的 DNA 含量等 。 3. 增加注样量，回收主峰平头部分。此时可达到去除杂质短链 DNA ，纯化目的 DNA 的目的。 为了确保 DNA 的纯度，一般一次的纯化量为 1 OD 左右。 4. 将回收后的 DNA 进行纯度检测，确认纯度的可靠性。 四 HAP 什么是HAP, HAP是英文HIGE AFFINITY PURIFICATIION的缩写。HAP方法是生工自主开发的新型oligo DNA纯化方法。。用HAP纯化的引物纯度可达98%以上，完全可与PAGE、HPLC方法媲美。 其原理是利用合成引物5’-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附、而不含DMT的短链DNA不被吸附，从而达到分离纯化的目的。 HAP方法的三大优势: 纯度高。用其纯化所得引物的纯度高达98%以上 (见图1)。可用于绝大多数分子生物学实验。 快速。用HAP方法纯化的引物一轮只需2小时，因而可比PAGE方法提前一天交货，节约您更多宝贵时间。 价格上更有竞争优势。由于HAP方法与PAGE、HPLC方法相比速度快、成本低，从而节约科研经费。 HAP引物的用途 用HAP方法纯化的引物可用于绝大多数分子生物学实验，包括DNA测序、基因合成、PCR反应、点突变、分子杂交和基因芯片技术等。其纯度对于一般的PCR实验而言更是绰绰有余。从2000年起，生工测序部和基因合成部所用引物均来自HAP方法。目前基因合成部更是每周需要HAP纯化的引物至少2000条。事实证明，HAP方法纯化的引物完全可以用于测序反应和基因合成等对引物纯度要求较高的实验。 五RPC纯化 RPC纯化是通过反相净化滤芯 (Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化，纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较，RPC是一种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如 C18的硅胶，能够很好的吸附DNA，并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、 PCR及基因合成等。 根据纯化方式的不同， DNA 制品可分为三个级别: OPC 级、 PAGE 级、高纯度级。 OPC 级制品 : 进行 OPC 纯化，纯度大于 95% 。