流式细胞仪结果分析.pptxVIP

第1页/共76页流式细胞仪结果分析第2页/共76页第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样品制备二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、免疫胶乳颗粒的应用四、流式细胞免疫学技术的质量控制第3页/共76页第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用思考题小结第4页/共76页流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 第5页/共76页流式细胞术的特点 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。 细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量第6页/共76页第一节 概述 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。第7页/共76页第8页/共76页流式细胞仪常检测的细胞特性细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA, RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子, PH值, 膜电位酶活性第9页/共76页一、工作原理 采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 第10页/共76页1.流式细胞仪的基本结构： （1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统第11页/共76页（1）液流系统由样本和鞘液组成待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 第12页/共76页喷嘴鞘液FluorescencesignalsFocused laserbeam液流系统示意图第13页/共76页FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）鞘液管样本管第14页/共76页（2）光学系统激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS, SS（散射光），FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）第15页/共76页FlowTipSS and FLDetectorFS DetectorLaser光学系统示意图第16页/共76页（3）数据处理系统主要由计算机及其软件组成第17页/共76页基本工作原理第18页/共76页硅化管形成稳态水平激光与之已标记的单细胞悬液和鞘液荧光染料被激发发光流动室喷嘴单细胞液柱垂直相交荧光检测系统和放大光电倍增管计算机系统分析结果收集光信号脉冲信号散射光感受系统基本过程第19页/共76页流式细胞仪与显微镜的区别区别流式细胞仪显微镜光源激光自然光、灯光对象细胞、生物粒子细胞、组织等承载工具鞘液及流动室载玻片检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT、放大电路目镜×物镜、光学放大统计计算机，5000人工，200结果多参数，综合分析简单，单参数第20页/共76页二、散射光的测定 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。第21页/共76页第22页/共76页 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。第23页/共76页LaserFALS Sensor前向散射光示意图第24页/共76页 侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。第25页/共76页LaserFALS Sensor90LS Sensor侧向散射光示意图第26页/共76页 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-