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多聚酶链式反应扩增 DNA 片段 教案 -CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN 《多聚酶链式反应扩增DNA片段》教学设计 教学目标 （一）知识与技能 1、了解PCR 技术的基本操作 2、理解PCR 的原理 3、讨论PCR 的应用 （二）过程与方法 在多聚酶链式反应扩增 DNA 片段的实验过程中，应避免外源 DNA 污染，严格 控制温度等反应条件 （三）情感、态度与价值观 通过对 PCR 实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科 研精神 教学重难点 教学重点： PC R 的原理和PCR 的基本操作 教学难点： PCR 的原理 教学工 多媒体 教学过程 （一）引入新课 在现代生物技术中，DNA 技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、 基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对 DNA 分子碱基序列的分析。而 分析 DNA 碱基序列，就需要一定量的 DNA 片段。怎样迅速获得足够量的 DNA 片段呢？今天我们来研究学习DNA 分子的扩增技术――PCR 技术。 （二）进行新课 1．基础知识 PCR 技术扩增DNA 的过程，与细胞内DNA 复制过程类似： 1．1 细胞内DNA 复制条件分析： 2 1．2细胞内DNA复制过程 （1）DNA的反向平行结构：（结合投影图） 核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图） 由核苷酸通过 3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向 性）。 DNA双螺旋结构的反向平行结构： （2）DNA的复制过程: 解 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。 引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单 链准确配对。 DNA聚合酶结合： 子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。 后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连 接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链） 子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。 感悟生命的神秘：DNA 聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功 能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往 下聚合，它不能从头合成。RNA 聚合酶没有校对功能，因此 RNA 的合成不需要 引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在 RNA 引物完成功能后即被 DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。 ［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？ DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。 ［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。 1．3DNA分子复制的人工控制 3 解开螺旋：在 80～100℃时，DNA 双螺旋打开，形成两条 DNA 单链，称为变 性。 恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA 单链重新形成双螺旋结构，称为复性。 复制条件：缓冲液,DNA 模板, 四种脱氧核苷酸,热稳定DNA 聚合酶,两种引物。 反应场所：PCR 仪（自动温度周期性调节）。 ［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分（核基质）1．4PCR 的反应过程 变性：在95 ℃时DNA 解旋 复性：在50℃时引物与DNA 单链结合 延伸：在72℃时合成DNA 子链（两个引物间的序列）2 ．实验操作 2 ．1 PCR 反应体系：缓冲液、DNA 模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA 聚 合酶、两种RNA 引物，水 2 ．2 实验操作步骤 2 ．3 按照PCR 反应体系配方配制反应液； （2 ）将PCR 反应体系50 μL 用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL ）中； （3 ）将微量离心管放到PCR 仪中； （4 ）设置PCR 仪的工作参数。 （5 ）DNA 在PCR 仪中大量扩增。 2 ．4 水浴法：将微型离心管依次在95 ℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理 相应时间。 3 ．实验注意事项 3 ．1 避免外源DNA 污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使